Cndt2_Châu Nguyên Huyền Trân_21126546_Thứ 2_789.Pdf

Giới thiệu Kể từ khi con người biết trồng trọt và chăn nuôi cho mục đích dùng làm thực phẩm, thì họ đã biết lựa chọn thực vật và động vật có đặc điểm lợi thế để làm giống.. Các đặc điểm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO MÔN HỌC

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

Ca học thực hành : Thứ 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO MÔN HỌC

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

TS PHẠM ĐỨC TOÀN CHÂU NGUYÊN HUYỀN TRÂN

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2.Tình hình sử dụng cây trồng biến đổi gen trên thế giới và của Việt Nam 1

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

2.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số 3

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 3

2.2.1.1 Hóa chất 3

2.2.1.2 Dụng cụ 4

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 4

2.2.2.1 Chuẩn bị mẫu 4

2.2.2.2 Các bước thực hiện 4

2.3 Kiểm tra GMO 6

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 6

2.3.1.1 Hóa chất 6

2.3.1.2 Dụng cụ 6

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 6

2.3.2.1 Thực hiện phản ứng PCR 6

2.3.2.2 Điện di 7

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8

3.1 Kết quả 8

3.1.1 Kết quả kiểm tra lượng DNA tổng số 8

3.1.2 Kết quả kiểm tra GMO 8

3.2 Thảo luận 9

3.2.1 Thảo luận về lượng DNA tổng số 9

3.2.2 Thảo luận về kiểm tra GMO 9

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phầm phản ứng PCR 6 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt độ 7

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Mẫu bắp số 2 3

Hình 2.2 Mẫu sau khi nghiền 4

Hình 2.4 Ly tâm mẫu 5

Hình 2.3 Thực hiện nghiền mẫu 5

Hình 2.5 Dịch nổi thu được 5

Hình 3.2 Kết quả đo OD 8

Hình 3.1 Kết quả diện di DNA tổng số 8

Hình 3.3 Kết quả diện di kiểm tra GMO mẫu 8

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu

Kể từ khi con người biết trồng trọt và chăn nuôi cho mục đích dùng làm thực phẩm, thì họ đã biết lựa chọn thực vật và động vật có đặc điểm lợi thế để làm giống Các đặc điểm này phản ánh những biến đổi về mặt di truyền xảy ra trong tự nhiên và kết quả là làm cho sinh vật đó có đặc điểm gia tăng về sản lượng hoặc khả năng kháng được bệnh hay trụ vững trước những áp lực từ môi trường

Ngày nay kỹ thuật hiện đại có thể cho phép chúng ta lựa chọn vật liệu di truyền để tạo ra thực vật, động vật, vi khuẩn và nấm có đặc điểm mới nổi trội Cho đến nay kỹ thuật này chủ yếu được sử dụng cho cây trồng để làm tăng khả kháng côn trùng, chịu được thuốc diệt cỏ; áp dụng trong vi sinh vật để sản xuất enzyme và gần đây là sử dụng

để làm tăng thành phần dinh dưỡng trong các sản phẩm cây trồng

Như vậy có thể đưa ra khái niệm về sinh vật biến đổi gen (GMO) như sau: sinh có có vật liệu di truyền (DNA) bị biến đổi theo cách không giống như hiện tượng xảy ra trong

tự nhiên được gọi là sinh vật biến đổi gen (GMO) Thực phẩm và thức ăn động vật có chứa hoặc sinh vật biến đổi gen hoặc được sản xuất từ sinh vật biến đổi gen được gọi là thực phẩm và thức ăn chăn nuôi biến đổi gen

Hiện nay thực phẩm biến đổi gen được sản xuất chủ yếu từ thực vật, nhưng trong tương lai thực phẩm xuất phát từ vi sinh vật biến đổi gen hay động vật biến đổi gen có thể được đưa ra thị trường Trong tương lai gần, biến đổi gen có thể đặt mục tiêu để lựa chọn đặc điểm về thành phần dinh dưỡng của thực phẩm, giảm khả năng gây dị ứng hoặc cải thiện hiệu năng của hệ thống sản xuất thực phẩm Theo quy định của luật pháp hiện hành thì tất cả thực phẩm biến đổi gen phải được đánh giá trước khi đưa ra thị trường

1.2 Tình hình sử dụng cây trồng biến đổi gen trên thế giới và của Việt Nam

Việc sử dụng giống cây trồng GMO trên thế giới hiện nay có hai luồng ý kiến khác nhau Một bên ủng hộ vì nhận thấy đây là tiến bộ khoa học hiện đại giúp gia tăng sản lượng cây trồng mà phương pháp tạo chọn giống cây trồng truyền thống không đáp ứng được Ngược lại, bên phản đối cho rằng cây trồng GMO có nguy cơ đem lại những hậu quả tiêu cực cho sức khỏe con người, động vật và đa dạng sinh học Sự tranh luận về

cây trồng GMO nói riêng hay sinh vật GMO nói chung đã tồn tại nhiều năm trên thế giới và còn kéo dài, và cũng chưa thể biết khi nào chấm dứt, hầu như ở nước nào cũng

có hai luồng ý kiến ủng hộ và phản đối

Các tổ chức và quốc gia ủng hộ giống cây trồng GMO theo nguyên tắc tuân thủ luật

an toàn sinh học của mỗi quốc gia đối với sinh vật GMO cũng như các định ước quốc tế

có liên quan đến sinh vật GMO như Ủy ban Codex, Hướng dẫn về An toàn sinh học để đảm bảo việc sử dụng giống cây trồng GMO an toàn Việc xét chấp thuận một giống cây trồng GMO cụ thể có được trồng trong sản xuất hay không căn cứ vào kết quả đánh giá tính toán đối với môi trường, sức khỏe con người và động vật của giống đó, nghĩa là từng từng giống GMO được xem xét, đánh giá trước khi cho phép được đưa ra thị trường Trên thực tế cho đến năm 2010, tức 15 năm sau khi giống cây trồng GMO được trồng đầu tiên trên thế giới có 29 nước đã trồng cây GMO trên đồng ruộng, trong đó có 8 nước thuộc EU là Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Tiệp Khắc, Ba Lan, Rumani, Đức và Slovakia Tổng diện tích cây trồng GMO trên thế giới năm 2010 là 148 triệu ha, trong đó ba cây trồng GMO chiếm diện tích lớn nhất là đậu tương (73,3 triệu ha), ngô (46,8 triệu ha), bông vải (21 triệu ha) Ở châu Á có 4 nước đã trồng giống cây GMO là Ấn Độ (9,4 triệu ha), Trung Quốc (3,5 triệu ha), Philípin (540.000 ha) và Myanma (270.000 ha) Ngoài các nước trồng và sử dụng giống cây trồng GMO, còn có 30 nước khác cho phép sử dụng nhập khẩu sản phẩm của giống cây trồng GMO làm thực phẩm và (hoặc) thức ăn chăn nuôi Như vậy, tổng số trên thế giới đã có 59 nước chấp thuận sử dụng sản phẩm cây trồng GMO

Đối với thực phẩm GMO đưa vào thị trường hiện nay trên thế giới có 2 hướng xử lý khác nhau Hướng buộc phải dán nhãn khi hàm lượng thành phần GMO trên ngưỡng nhất định như Úc trên 1%, Nhật Bản trên 5%, Indonesia trên 5%, Ả Rập xê-út trên 1%, Hàn Quốc trên 3%, Đài Loan trên 5%, Thái Lan trên 5%, Châu Âu trên 0,9%, Brazil trên 1%, Việt Nam quy định dán nhãn nhưng chưa xác định cụ thể ngưỡng (điều 44 của Luật An toàn thực phẩm).Hướng chấp thuận không phải dán nhãn gồm Mỹ, Canada, Philippin, Nam Phi, Ác-hen-tina

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: ngày 20 và ngày 27 tháng 05 năm 2024

Địa điểm: Phòng 101, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1.1 Hóa chất

- Dung dịch CI

- Isopropanol

- Ethanol 70%

- TE Buffer

- Gel agarose 1%

- Dung dịch TBE 0,5X

- Gel Red

- Ladder

- Mẫu bắp (số 2) thức ăn cho gia súc - cần xác định có GMO hay không

Hình 2.1 Mẫu bắp số 2

2.2.1.2 Dụng cụ

- Bồn điện di

- Máy ly tâm

- Máy PCR

- Micropipet

- Dụng cụ nghiền

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Chuẩn bị mẫu

Thực hiện nghiền nhỏ mẫu bắp càng nhỏ càng tốt để dễ dàng cho quá trình li trích DNA

2.2.2.2 Các bước thực hiện

Bước 1: Lấy 0.05 g mẫu sau nghiền bỏ vào tube Cho vào 600 ml nước cất, dùng dụng cụ nghiền để nghiền nhỏ mẫu bên trong tube cho đến khi mẫu và nước hòa lẫn vào nhau

Hình 2.2 Mẫu sau khi nghiền

Bước 2: Ly tâm 10 000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút

Bước 3: Hút và thu nhận dịch nổi bên trên sang tube mới

Hình 2.3 Thực hiện nghiền mẫu

Hình 2.5 Dịch nổi thu được

Hình 2.4 Ly tâm mẫu

Bước 4: Cho 1V PCI trồn đều, ly tâm 10 000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút Bước 5: Hút dịch nổi sang tube mới, thêm 1V CI trộn đều

Bước 6: Ly tâm 10 000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút

Bước 7: Hút dịch nổi sang tube mới (250 - 300 ml), thêm 0.6X của V isopropanol ủ

ở -20oC trong 30 phút

Bước 8: Ly tâm 10000 vòng trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

Bước 9: Thêm 500 mL Ethanol 70o, ly tâm 10 000 vòng/ phút trong thời gian 3 phút (lặp lại 1 lần nữa)

Bước 10: Phơi khô, thêm 50 𝜇L TE vào và bảo quản -20 oC

Thực hiện điện di để kiểm tra lượng DNA tổng số và ghi nhận kết quả

2.3 Kiểm tra GMO

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1.1 Hóa chất

- Primer F (P35S)

- Primer R

- Gel Red

- Loading dye

- Nước khử ion

- Ladder

2.3.1.2 Dụng cụ

- Bồn điện di

- Tube PCR

- Máy PCR

- Gel agarose

- Pipet

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Thực hiện phản ứng PCR

Thực hiện chuẩn bị theo bảng thành phần bên dưới và cho mẫu vào thiết bị để chạy PCR

Bảng 2.1 Thành phầm phản ứng PCR

Mồi xuôi (10 µM) 0,25 µL

Mồi ngược (10 µM) 0,25 µL

Nước khử ion 4,75 µL

DNA template 1 µL

Master mix (2X) 6,25 µL

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt độ

Tiền biến tính 95oC 5 phút 1

Biến tính 95oC 30 giây 40

Bắt cặp 60oC 30 giây 40

Kéo dài 72oC 30 giây 40

Hậu kéo dài 72oC 30 giây 1

Bảo quản 4oC ∞ 1

2.3.2.2 Điện di

Bước 1: Chuẩn bị sẵn 10 μL dung dịch (gel red + loading dye) và trộn cùng với 5

μL mẫu

Bước 2: Thực hiện thao tác bơm 15 μL dung dịch đã trộn ở trên vào giếng Bước 3: Tiến hành điện di ở hiệu điện thế và ghi nhận kết quả

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả

3.1.1 Kết quả kiểm tra lượng DNA tổng số

3.1.2 Kết quả kiểm tra GMO

Hình 3.1 Kết quả diện di DNA tổng số

2

Hình 3.2 Kết quả đo OD

Hình 3.3 Kết quả diện di kiểm tra GMO mẫu

Ladder GMO Non GMO 2

3.2 Thảo luận

3.2.1 Thảo luận về lượng DNA tổng số

Từ kết quả hình 3.1, hiển thị band của mẫu ở vị trí giếng số 2 sau nhưng vạch sáng xuất hiện mờ và không được rõ ràng Mẫu ở giếng này vẫn có thể tiến hành ở các bước tiếp theo

Nguyên nhân mẫu không hiển thị band rõ ràng có thể do trong quá trình thao tác mix mẫu chưa đều hoặc bơm mẫu DNA vào bị tràn khỏi giếng và không đủ thể tích mẫu

Từ kết quả hình 3.2, ghi nhận được nồng độ đo OD ghi nhận được của mẫu DNA này

là 0.137 ng/μL Với OD A260/280 (DNA/ Protein) của mẫu ghi nhận được là 2.043 ng/μL, mẫu DNA thực hiện cho ra kết quả sạch, ít bị tạp nhiễm và lượng DNA cao

Từ kết quả hình 3.3, hiển thị 2 band của mẫu ở vị trí giếng số 2 Mẫu bắp số 2 ghi nhận dương tính với GMO

Nguyên nhân xuất hiện 2 band ở mẫu này có khả năng do mẫu bắp này đã bị biến đổi chứa 2 gen Việc cây trồng chứa GMO có thể do một số tác nhân như côn trùng thụ phấn, gió từ việc giao phối gần gây nên