luận văn thạc sĩ thiết kế đầu dò adn cho kỹ thuật lai dot blot

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Nguyễn Thị Thu Hƣờng THIẾT KẾ ĐẦU DÒ ADN CHO KỸ THUẬT LAI DOT BLOT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 z ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Nguyễn Thị Thu Hƣờng THIẾT KẾ ĐẦU DÒ ADN CHO KỸ THUẬT LAI DOT BLOT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: PGS TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2013 z Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Võ Thị Thương Lan, người bảo tận tình suốt q trình tơi thực đề tài Cô không truyền thụ cho nhiều kiến thức chun mơn mà cịn giúp tơi bồi đắp lịng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Đó tảng cho q trình thực luận văn, hành trang giúp tự tin vững bước đường khoa học sau Tơi xin trân trọng cảm ơn ThS Tạ Bích Thuận Cô động viên, dành cho nhiều lời khun q báu lúc tơi gặp khó khăn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Ngô Thị Hà, NCS Vương Diệu Linh, ThS Lê Hồng Thu, CN Trần Tuấn Anh bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Sinh Y thuộc Khoa Sinh học, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống Phòng Genomic thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym - Protein giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ anh trai, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ nhiều vật chất lẫn tinh thần để hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Thu Hường Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 z Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic bp Base pair (cặp bazơ) cs Cộng codon Cd Da Dalton dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dUTP Deoxyuridine triphosphate H2O Nƣớc kb Kilobase = 1000 bp M Mol/lit PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Saline Sodium Citrate TBE Đệm Tris - Borate - EDTA Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 z Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng Đặc điểm số loại màng dùng kỹ thuật lai axit nucleic 19 Bảng Thành phần dung dịch dùng quy trình lai điểm lai 27 điểm ngƣợc Bảng Trình tự mồi dùng nghiên cứu kích thƣớc sản 28 phẩm PCR tƣơng ứng Bảng Trình tự đầu dò oligo dùng kỹ thuật lai điểm ngƣợc 28 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn C T 31 Bảng Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng phân tách ADN 38 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng khuếch đại đầu dò M 39 Bảng Thành phần điều kiện tối ƣu phản ứng đánh dấu đầu dò M 40 với biotin DIG Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng 48 thời đột biến Cd 17, Cd 26 Cd 41-42 gen β-globin Bảng 10 Kết sàng lọc đột biến Cd 17, Cd 26 Cd 41-42 30 50 mẫu bệnh phẩm phản ứng PCR đa mồi Bảng 11 Thành phần điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R 50 khuếch đại đoạn gen β-globin kích thƣớc 700 bp Bảng 12 Thành phần điều kiện phản ứng đánh dấu trình tự đích cho kỹ 53 thuật lai điểm ngƣợc Bảng 13 Tần số đột biến gây bệnh β-thalassemia số quốc gia giới Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 z 61 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình Trang Mơ hình chuỗi xoắn kép, liên kết hydro phosphodieste 03 phân tử ADN Hình Sự biến tính hồi tính phân tử ADN sợi kép 04 Hình Các phân tử sợi kép hình thành phản ứng lai axit nucleic 05 Hình Đánh dấu đầu dị phƣơng pháp dịch chuyển điểm đứt 07 Hình Đánh dấu đầu dò phƣơng pháp dùng mồi ngẫu nhiên 08 Hình Nguyên lý chung hệ thống đánh dấu khơng phóng xạ gián tiếp 12 Hình Cấu trúc phân tử digoxigenin-11-dUTP biotin-16-dUTP 13 Hình Tính tƣơng đồng đoạn C, T M 25 Hình Vị trí đầu dị oligo cặp mồi CD F/R gen β-globin 30 Hình 10 Kết đánh dấu đầu dò M với biotin DIG 41 Hình 11 Kết so sánh hiệu đánh dấu biotin DIG kiểm tra độ 42 nhạy kỹ thuật lai điểm Hình 12 Kết điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn C đoạn T 43 Hình 13 Kết lai điểm phân biệt đoạn C đoạn T 650C 44 Hình 14 Kết lai điểm với loại ADN khác chứa đoạn C 45 đoạn T Hình 15 Kết lai đầu dị M với plasmid khơng mang đoạn chèn C T 46 Hình 16 Kết lai điểm với plasmid pBluescript cặp mồi M13 F/R 47 Hình 17 Sơ đồ minh họa vị trí mồi sử dụng phản ứng PCR đa mồi 49 Hình 18 Kết điện di sản phẩm PCR đa mồi 49 Hình 19 Kết tinh sản phẩm PCR mẫu T9 với cặp mồi CD F/R 51 Hình 20 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen khuếch đại 52 cặp mồi CD F/R với ngân hàng liệu NCBI Hình 21 Kết đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot z 54 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Hình 22 Chuẩn hóa lƣợng đầu dò chấm lên màng kỹ thuật lai điểm 55 ngƣợc Hình 23 Kết lai điểm ngƣợc phát đột biến gen β-globin 55 cặp đầu dị Hình 24 Kết lai điểm ngƣợc phát đồng thời ba đột biến gen β-globin Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot z 57 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN 1.2 NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 1.3 ĐẦU DÒ 1.3.1 Đặc điểm đầu dò kỹ thuật lai axit nucleic 1.3.2 Các phƣơng pháp đánh dấu đầu dò 1.3.3 Các chất đánh dấu đầu dò 1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 13 1.4.1 Lai chỗ 13 1.4.2 Lai pha lỏng 15 1.4.3 Lai pha rắn 15 1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KỸ THUẬT LAI PHA RẮN 18 1.6 ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 20 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Các mồi 27 2.1.4 Các đầu dò oligo 28 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot z luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 2.1.5 Màng lai 29 2.1.6 Thiết bị 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Thiết kế đầu dò 29 2.2.2 Phƣơng pháp PCR 30 2.2.3 Quá trình lai điểm 31 2.2.3.1 Biến tính cố định ADN màng nylon (Roche) 31 2.2.3.2 Tiền lai lai 32 2.2.3.3 Phát đầu dò 33 2.2.4 Quá trình lai điểm ngƣợc 34 2.2.4.1 Hoạt hóa màng nylon (Pall) 34 2.2.4.2 Cố định đầu dò màng nylon (Pall) 34 2.2.4.3 Tiền lai lai 34 2.2.4.4 Phát đầu dò đánh dấu biotin 35 2.2.5 Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm 35 2.2.6 Tách plasmid 36 2.2.7 Tinh sản phẩm PCR kit High pure PCR cleanup micro 37 2.2.8 Phƣơng pháp điện di 37 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 A - KẾT QUẢ 39 3.1 QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM 39 3.1.1 Kết khuếch đại đánh dấu đầu dò M 39 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot z luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 3.1.2 So sánh hiệu đánh dấu với biotin DIG 41 3.1.3 Chuẩn bị trình tự đích trình tự đối chứng 42 3.1.4 Kết lai điểm phân biệt trình tự đích trình tự đối chứng 43 3.2 QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƢỢC 47 3.2.1 Sàng lọc số đột biến gen β-globin 47 3.2.2 Chuẩn bị đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngƣợc 52 3.2.3 Kết lai điểm ngƣợc phát đột biến gen β-globin 54 B - THẢO LUẬN 57 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 72 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 luan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blotluan.van.thac.si.thiet.ke.dau.do.adn.cho.ky.thuat.lai.dot.blot z