kiểm nghiệm clostridium

kiểm nghiệm clostridium tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh vực kinh...

CHƯƠNG I CLOSTRIDIUM

1) Giới thiệu:

Clostridium là một giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes Đây là những

vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả năng sinh nha bào khi môi trường sống bất lợi Tên của chúng bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp kloster (κλωστήρ) có nghĩa trục quay Từ những đặc điểm điển hình trên, người ta xếp các vi khuẩn vào giống Clostridium, tuy nhiên gần đây nhiều chủng đã được phân loại vào các giống khác Giống Clostridium bao gồm khoảng 100 loài, có những chủng

sống tự do trong môi trường và một số hiện diện như những mầm bệnh tiềm ẩn với con người Trong nhóm này có bốn vi khuẩn chủ yếu gây bệnh cho con người:

• C botulinum, có khả năng sinh độc tố trong thức ăn, vết thương gây ra bệnh độc thịt Đặc điểm

chung của các loài vi khuẩn thuộc giống C botulinum là có khả năng sản sinh độc tố thần kinh.

Hiện có bảy loại độc tố được đặt tên theo các chữ cái (A-G) Phần lớn các chủng cùng sản sinh một loại độc tố thần kinh nhưng đồng thời cũng sinh ra nhiều loại độc tố khác đã được ghi nhận

C botulinum sinh độc tố B và F được phân lập từ những trường hợp bệnh nhiễm độc thịt ở người

tại New Mexico và California Một loại độc tố mới đã được xác định là Bf thuộc nhóm B ngoài độc tố F được tìm thấy Tương tự, các chủng sản sinh độc tố Ab và Af đã được báo cáo Các loài

Clostridium đã được xác định gây ra bệnh độc thịt; Clostridium butyricum sản sinh ra độc tố E

và Clostridium baratii sản sinh độc tố F Khả năng của C botulinum chuyển gen mã hóa việc

tổng hợp độc tố thần kinh cho các loài clostridia đang được quan tâm, đặc biệt trong công nghiệp

thực phẩm nơi mà hệ thống bảo quản cần được thiết kế để tiêu diệt hay vô hiệu hóa loài C botulinum nhưng không làm ảnh hưởng đến các loài khác thuộc giống Clotridium Trong mật ong đôi khi có thể tồn tại nha bào của Clostridium botulinum Người lớn và trẻ lớn tuổi hơn có

thể ăn mật ong mà không bị bệnh vì Clostridium không thể thích nghi trong đường tiêu hóa ở phần dạ dày ruột

• C difficile, tồn tại như là mầm bệnh cơ hội thuộc hệ vi sinh vật ở ruột và phát triển khi có điều kiện nhất là trong liệu pháp chữa trị bằng kháng sinh và gây ra chứng viêm đại tràng màng giả

• C perfringens, ban đầu có tên C welchii, là nguyên nhân gây ra một loạt các hội chứng khác

nhau, từ ngộ độc thức ăn cho đến bệnh hoại thư sinh hơi Loài này cũng sản sinh ra độc tố ruột

phương pháp bánh mì muối Nó là loài kị khí không bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trong môi trường Ellner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline Loài này có 6 kiểu kháng nguên được ki81 hiệu từ A-F Kiểu kháng nguên A thường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm

• C tetani, gây ra bệnh uốn ván C.terani là loài kị khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với không khí Loài này có đặc điểm tạo khối kết tụ khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng Loài này được tìm thấy trong đấy, trong phân các loài động vật và người

Một vài trường hợp tử vong ở những người phụ nữ sau khi sinh nở được ghi nhận là do C

sordellii

Giống Clostridium đôi khi được tìm thấy trên những lồng chim kiểu Trung Quốc Vì vậy những

lồng chim này cần phải qua bước diệt khuẩn bằng sunfite trước khi nhập khẩu vào thị trường

Mỹ

Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri

ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 370C trong 1-2 ngày Nếu nghi ngờ có Clostridium

ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 500C Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do

phản ứng giữa ion sulphide S2- và ion sắt Fe2+ có trong môi trường

) Phương pháp xác định

.1 Môi trường và hóa chất

- Pepton đệm Buffered Peptone water (BPW)

- Iron Sulphite Agar (ISA)

- Perfringens selective Agar (hay Shahidi ferguson Perfringens, SFP)

Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 450C và được phân tích ngay sau khi giải đông Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước peptone đệm

và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu Mẫu được tiếp tục pha loãng thập phân tùy mật độ hiện

diện của Clostridium trong mẫu Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 - 800C trong 20 phút

để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác

Cấy vào đĩa vô trùng 1ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô trùng Đỗ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 450C vào đĩa, lắc đều Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm trên bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP agar Một phương pháp khác là cho vào một ống nghiệm vô trùng 1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA hay SFP agar đã được ủ ấm ơ 450C vào ống, trộn đều mẫu Sau khi môi đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt 2 - 3ml ISA hoặc SFP agar Đĩa hoặc ống nghiệm đã cấy mẫu được ủ ở 370C trong

24 - 48 giờ trong các bình kị khí Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực hiện ủ song song ở

370C và 500C Thông thường việc đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm

ISA là môi trường không chọn lọc nên các loài vi khuẩn sinh H2S khác không phải là Clostridium cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường này Để khẳng

định là khuẩn lạc Clostridium cần thực hiện thêm những qui trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định

kết quả

Ví dụ Xác định Clostridium botulinum

Ta dùng các phương pháp :

Phương pháp truyền thống : Dựa vào đặc sinh hoá của Clostridium botulinum mà ta kiểm tra các phản ứng sinh hoá nhằm khẳng định Clostridium botulinum.

Phương pháp hiện đại phương pháp PCR : Dựa vào kết quả điện di

.3 Báo cáo kết quả

Đếm tất cá các khuẩn lạc đen, hoặc có thể bao quanh bởi vòng đen Mật độ Clostridium

trong mẫu được tính từ số khuẩn lạc đếm được nhânvới hệ số pha loãng và được trình bày ở dạng CFU/g hay CFU/ml sản phẩm Qui trình định lượng được tóm tắt như sau:

Hình ảnh thực phẩm có chứa Clostridium

Các loại thực phẩm nhiễm Clostidium botulinum

Vi khuẩn gây bệnh uốn ván là Clostridium Tetani, nằm trong đất, bùn Mật ong nhiễm bào tử C botulinum gây bệnh ở trẻ

CHƯƠNG II PSEUDOMONAS AERUGINOSA

1) Giới thiệu:

• Từ Pseudomonas có nghĩa bộ phận giả, bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp pseudo- (Tiếng Hi Lạp cổ:

ψευδο, giả) và từ monas (tiếng Latin: monas, từ tiếng Hi Lạp cổ: μονος, một bộ phận duy nhất).

Thuật ngữ mon được sử dụng vào thuở ban đầu của lịch sử vi sinh học để đề cập đến mầm bệnh,

ví dụ, Giới Monera

• Những loài mang tên aeruginosa trong tiếng La tin có nghĩa là gỉ đồng, giống như lớp đồng bị

oxy hóa trên tượng Nữ thần Tự do Điều này cũng được dùng để miêu tả sắc tố lam-lục của vi khuẩn trong nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Sắc tố lam-lục là một hợp chất của hai chất

chuyển hóa do P aeruginosa tiết ra, pyocyanin (lam) và pyoverdine (vàng), hai sắc tố này kết

hợp với nhau tạo ra sắc tố lam-lục của môi trường nuôi cấy Sự tổng hợp Pyocyanin được điều hòa bởi sự cảm biến túc số như trong các màng sinh học liên hệ với sự cư trú của các vi khuẩn tại

phổi trong các bệnh nhân xơ nang Một khẳng định khác là từ này có lẽ bắt nguồn tiền tố tiếng

Hi Lạp ae- nghĩa là "cũ hay già nua, và hậu tố ruginosa có nghĩa nhăn nheo hay lỗ chỗ.

• Nguồn gốc của hai từ pyocyanin và pyoverdine cũng là từ tiếng Hi Lạp, với pyo-, nghĩa là mủ, cyanin, nghĩa là lam, và verdine, nghĩa là lục Nếu sắc tố pyoverdine xuất hiện riêng lẻ không

có sắc tố pyocyanin thì có màu vàng ánh bạc

• Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến gây

bệnh ở động vật và con người Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí ôxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; ở động vật, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho phép nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây

ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người; vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể Vi khuẩn cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa

bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩnbệnh viện và phòng mạch Đây cũng là nguyên nhân gây

ra viêm chân lông

2) Đặc điểm

Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que với khả năng di chuyển một cực Ngoài việc một là mầm bệnh cơ hội cho con người, P aeruginosa còn được biết đến như là mầm bệnh

cơ hội cho thực vật P aeruginosa là loài điển hình thuộc giống Pseudomonas (Migula )

P aeruginosa có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố, bao gồm pyocyanin (lam-lục),

King, Ward, và Raney đã tìm ra thạch Pseudomonas Agar P (môi trường aka King A) để tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết pyocyanin và pyorubin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trường aka King

B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết sắc tố fluorescein P aeruginosa thường được xác định sơ bộ

bởi vẻ ngoài óng ánh như hạt trai và có mùi giống như nho hoặc bánh tortilla khi được nuôi cấy

in vitro Các triệu chứng khẳng định sự có mặt của P aeruginosa trong lâm sàng thường bao

gồm khả năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát triển tại nhiệt

độ 42 °C P aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel và nhiên liệu máy bay, nơi mà vi khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụng hydrocarbon (hay "HUM bug"), và gây ra sự ăn mòn

vi thể Nó tạo nên một lớp mờ tối đôi khi được gọi không chính thức là "algae" bởi vì vẻ ngoài của chúng

Mặc dù được phân loại là một sinh vật hiếu khí, P aeruginosa còn được xem như là sinh

phần khí oxy Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat nó cũng có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất Khả năng thích nghi trong môi trường vi hiếu khí hay kị khí mang ý nghĩa quan rất quan

trọng đối với cơ chế sinh bệnh của P aeruginosa, ví dụ, ở những bệnh nhân bị viêm phổi do

khuếch tán của oxy vào máu

Nhiễm sắc thể của Pseudomonas aeruginosa được cấu tạo phần lớn bởi nucleotid loại

G+C, bao gồm một lõi chính được bảo tồn và các phần phụ khác nhau Bộ gen lõi của các dòng

P aeruginosa phần lớn là giống nhau, biểu hiện sự đa dạng thấp, và chỉ chứa vài locus quy định những tính trạnh nổi bật, như locus pyoverdine, flagella, pilA, và locus sinh tổng hợp kháng thể

O Những đoạn gen quy định các tính trạng nằm rải rác khắp bộ di truyền và khoảng một phần ba trong số chúng nằm kề sát các gen tRNA hay tmRNA Ba điểm chính được biết tới nhờ tính đa dạng di truyền của vi khuẩn gây ra bởi sự tương tác lẫn nhau giữa các họ đảo gen pKLC102 / PAGI-2 vào các gen tRNALys hay tRNAGly Các đảo gen riêng lẻ khác nhau về thứ tự các gen trao đổi chất, nhưng giống nhau về các gen tương kề truyền lại trực tiếp cho các chủng và các loài Các bệnh không điển hình thường là do đột biến khuyết chức năng mất, tái cấu trúc, và lặp các đoạn gen trong bộ nhiệm sắc thể P aeruginosa Số lượng của loài P aeruginosa chủ yếu được

đặc trưng bởi một vài chủng gây bệnh phân bố rộng trong môi trường sống Bộ gen được cấu thành bởi các phân đoạn gen của dòng vô tính điển hình trong lõi với dòng gen không bị giới hạn trong dân số

Là một mầm bệnh cơ hội gây nhiễm trùng bệnh viện tấn công các bệnh nhân bị suy giảm

vết thương, và còn gây ra nhiễm trùng huyết

Nhiễm trùng bệnh viện

Nhiễm trùng bệnh viện

Viêm phổi

Nhiễm trùng huyết

Nhiễm trùng đường niệu

Gastrointestinal infection

Nhiễm trùng da và mô mềm

3) Phương pháp xác định

3.1) Môi trường và hóa chất

- Môi trường canh Modified Letheen Broth (MLB)

- Môi trường chọn lọc Enterobacteriaceae (EMB Agar, Endo Agar, Deoxycholate Agar,

MacConkey Agar, Hektoen Enteric Agar và XLD Agar)

- Thạch nghiêng YE

- Môi trường thạch Simmons Citrate Agar (SCA)

- Môi trường canh Nitrate Broth

- Môi trường canh Koser’s Citrate Broth

- Môi trường thạch Christensens Citrate Sulfide Agar (CCSA)

- Môi trường canh malonate Broth

- Môi trường canh Nitrate Motility agar

- Môi trường Arginine decarboxylase Broth

- Môi trường Nutrient Gelatin

- Môi trường thạch Pseudomonas agar F

- Môi trường thạch Pseudomonas agar P

- Môi trường Cetrimide oxidase

- Môi trường thạch TSA

- Thuốc thử nghiệm oxidase

- Hóa chất nhuộm gram

- Thuốc thử nhuộm tiên mao

3.2) Qui trình phân tích

Đối với mẫu mĩ phẩm, tùy đặc tính vật lý của mẫu, mẫu được xử lý và chuẩn bị một cách khác nhau Thông thường 1ml mỹ phẩm dạng lỏng được bổ sung vào 9ml môi trường canh MLB, 1g mỹ phẩm dạng kem hoặc bột được bổ sung vào ống nghiệm chứa 1ml Tween 80, sau

đó bổ sung 8ml canh MLB để thu được mẫu pha loãng 10-1

Quy trình của FDA (Food and Drug Administration)

Dùng que cấy vòng tiến hành ria mẫu lên một trong các môi trường chọn lọc như EMB agar, Endo agar, Deoxycholate agar, MacConkey agar, Hektoen Enteric agar và XLD agar để

phân lập họ Enterobacteriaceae và giống Pseudomonas, ủ ở 370C, 24 giờ Các môi trường này

là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, nhưng các giống khác nhau cho khuẩn lạc có hình

thái đặc trưng khác nhau trên môi trường này Ví dụ, trên môi trường XLD, E.coli có khuẩn lạc

dẹt, màu vàng, một vài chủng còn không mọc được salmonella cho khuẩn lạc màu đỏ có tâm

đen, Pseudomonas cho khuẩn lạc màu đỏ không có tâm đen Các khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cho Pseudomonas được dùng để nhuộm gram, trước tiên được thử nghiệm TSI, oxidase,

sau đó thử nghiệm các đặc trưng sinh hóa khác như sau:

- Nhuộm gram: việc nhuộm gram có thể được thực hiện bằng phương pháp Jensen hay phương

pháp Hucker Trước tiên, tạo vệt bôi vi sinh vật trên phiến kính Chọn một phiến kính sạch, dùng bút ghi trên kính vẽ 1 vòng tròn đường kính khoảng 2cm ở mặt dưới của phiến kính Đặt ở vị trí tương ứng với vòng đánh dấu ở mặt trên của phiến kính vài giọt nước cất thành một giọt lớn Dùng que cấy vòng chuyển vài vòng dịch tế bào lên vùng vòng tròn ở trung tâm bề mặt phiến kính, bôi đều trong khu vực của vòng tròn Để yên cho vệt bôi khô Dùng tay giữ 2 cạnh của một đầu phiến kính, đưa phiến kính(ở vị trí cạnh vệt bôi) qua lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen để cố định vệt bôi trên kính Tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa Thực

hiện tương tự để tạo một vệt bôi chung hai chủng vi sinh vật đối chứng trong cùng một phiến kính khác

- Theo phương pháp Jensen: Nhỏ vài giọt dung dịch methyl violet lên vệt bôi, giữ yên trong 20

giây Dùng bình xịt nước, bơm nước lên vệt bôi, rửa phẩm nhuộm đến vừa mất màu Để yên vài giây sau đó rửa sạch lại bằng nước Nhuộm bằng dung dịch safrarin 30 giây Rửa sạch bằng nước Thấm nước dư bằng giấy lọc Theo phương pháp của Hucker, bằng thao tác tương tự như

ở phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi 1 phút bằng dung dịch crystal violet Rửa bằng nước Nhuộm bằng dung dịch KI/I2 trong 1 phút.Khử màu bằng cách xịt cồn 95% cho đến khi sạch màu Rửa lại bằng nước và nhuộm bằng dung dịch safrarin trong 2 phút

- Thử nghiệm TSI: khuẩn lạc đặc trưng cho Pseudomonas được cấy chuyền sang ống thạch

nghiêng TSI, ủ 24 giờ ở 350C P.aeruginosa cho phản ứng kiềm hóa ở cả 2 phần thạch nghiêng

và phần sâu (màu môi trường đỏ), không sinh hơi (một vài chủng sinh H2S nhẹ)

- Thử nghiệm oxidase: cắt một miếng giấy lọc thành những dải nhỏ dài 10x40mm Nhùng vào

hóa chất dùng cho thử nghiệm oxidase, thấm bớt dịch hóa chất thừa bằng giấy thắm Tránh để giấy lọc tẩm thuốc thử trực tiếp ngoài sáng lâu vì ánh sáng phân hủy hóa chất Để khô ở 350C và giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng Sử dụng que cấy vòng bằng bạch kim chuyển sinh khối lên một phần giấy lọc (dây bằng nichrome có thể cho phản ứng (+) giả) Đọc kết quả sau 10 giây, không được để vượt quá thời gian này Phản ứng oxidase là (+) khi có sự xuất hiện màu đỏ tía

đậm, là (-) khi giấy lọc không màu hoặc xuất hiện màu đỏ tía sau 10 giây P.seudomonas spp có

phản ứng oxidase (+)

- Sau khi kiểm chứng được chúng là Gram (-), không sinh H2S trên môi trường TSI và oxidase (+) Các khuẩn lạc thuẩn này tiếp tục thử nghiệm các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định chủng nghi

ngờ là P.aeruginosa như sau: khả năng ở 420C, thử nghiệm biến dưỡng citrate, malonate, nitrate, thử nghiệm ADH, geletinase

- Khả năng tăng trưởng ở 42 0 C trên môi trường YE : cấy từ một khuẩn lạc thử nghiệm lên 2

ống thạch nghiêng YE, 1 ống ủ ở 350C trong 24 giờ, ống còn lại ủ ở 420C trong 24 giờ Ống môi trường dùng để ủ ở 420C cần được ủ đạt đến nhiệt độ này trước khi cấy chủng thử nghiệm vì một

số loài Pseudomonas có thể mọc chậm ở 420C trên môi trường chưa ủ, nhưng không thể mọc

được trên môi trường đã được làm ấm trước đó Trên môi trường này, P.aeruginosa tằng trưởng

được ở 420C và tạo ra mùi cá do trimelthylamine

- Thử nghiệm biến dường citrate: cấy và ủ khuẩn lạc thử nghiệm trên môi trường canh Koser’s Citrate Broth ở 350C trong 24-48 giờ P.aeruginosa sử dụng được citrate để tăng trưởng và làm đục môi trường Có thể thực hiện thử nghiệm này bằng cách sử dụng các môi trường thạch như SCA hay môi trường CCSA như được trình bày trong chương IV

- Thử nghiệm biến dưỡng malonate: cấy và ủ khuẩn lạc thử nghiệm trên môi trường canh

Malonate Broth ở 350C trong 24 giờ P.aeruginosa sử dụng được malonate làm nguồn carbon

duy nhất để tăng trưởng và làm môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương

- Thử nghiệm sử dụng nitrate (thử nghiệm nitratase): cấy ria khuẩn lạc thử nghiệm trên bề mặt

và đâm sâu xuống thạch Nitrate Motility Agar trong ống thạch sâu Ủ ở 350C trong 24 giờ Nhỏ vài giọt sulfanilic acid và naphthylamine Nếu xuất hiện màu hồng đậm hay màu đỏ chứng tỏ có

sự biến đổi nitrate thành nitrite Ngoài ra, nếu môi trường không đổi màu nhưng có sự tạo thành bọt khí hoặc làm rạn nứt môi trường cũng được xem là phản ứng (+) do sự khử nitrate thành

nitrite để giải phóng nitơ P.aeruginosa cho kết quả (+) Có thể thực hiện thử nghiệm này trên

môi trường Nitrate Broth Chú ý luôn luôn thực hiện song song một ống đối chứng ở cùng điều

kiện, không được cấy giống P.aeruginosa có thử nghiệm nitratase (+).