Microsoft Word Luận văn đã bảo vệ docx 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT NGUYỄN THÙY HƯƠNG TRANG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI TRỒNG NHÂN TẠO LOÀI NẤM PHỤC LINH (WOLFIPORIA COCOS) TẠI[.]
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT NGUYỄN THÙY HƯƠNG TRANG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI TRỒNG NHÂN TẠO LỒI NẤM PHỤC LINH (WOLFIPORIA COCOS) TẠI ĐÀ LẠT LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM Lâm Đồng, năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI TRỒNG NHÂN TẠO LOÀI NẤM PHỤC LINH (WOLFIPORIA COCOS) TẠI ĐÀ LẠT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: TS Trương Bình Nguyên Học viên thực : Nguyễn Thuỳ Hương Trang LỜI CẢM ƠN Trong luận văn thạc sĩ với đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình ni trồng nhân tạo lồi nấm Phục linh (Wolfiporia cocos) Đà Lạt” kết trình cố gắng thân giúp đỡ, động viên khích lệ thầy cơ, bạn bè đồng nghiệp người thân Qua trang viết xin gửi lời cảm ơn tới người giúp đỡ thời gian học tập – nghiên cứu khoa học vừa qua Tơi xin tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc giảng viên hướng dẫn Tiến sĩ Trương Bình Nguyên trực tiếp tận tình hướng dẫn cung cấp tài liệu thông tin khoa học cần thiết cho luận văn Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo trường Đại học Đà Lạt, phịng thí nghiệm Nấm học - Khoa Sinh lãnh đạo Công ty cổ phần Nguyên Long tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu khoa học Cuối tơi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, đơn vị công tác Viện Nghiên cứu Hạt nhân giúp đỡ trình học tập thực luận văn Tác giả Nguyễn Thùy Hương Trang LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Trương Bình Ngun Những kết của người khác số liệu trích dẫn luận văn thích đầy đủ Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường cam đoan Lâm Đồng, ngày tháng năm 2023 Tác giả Nguyễn Thùy Hương Trang Bảng kí hiệu viết tắt Stt Kí hiệu viết tắt Nội dung cụ thể PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth PD PGA C Cacbon N Nitơ CB Cám bắp TL Thóc luộc CG Cám gạo 10 GK Gỗ khúc 11n MT Môi trường Potato Dextrose Potato Glucose Agar Gyeongbuk Agricultural 12 GARES Research and Extension Services 13 M Maltose 14 G Glucose 15 F Fuctose 16 NJ Neighbour Joining 17 MP Maximum Parsimony 18 ML Maximum Likelihood 19 ITS Internal transcribed spacer HỆ THỐNG BẢNG VÀ HÌNH TRONG LUẬN VĂN Bảng Triterpenes phân lập từ Poria cocos Bảng Thành phần chất môi trường mùn cưa có bổ sung cám gạo Bảng Thành phần chất mơi trường mùn cưa có bổ sung cám bắp Bảng Thành phần chất môi trường mùn cưa có bổ sung thóc luộc Bảng Giống mẹ thí nghiệm gỗ khúc Bảng Bảng Bảng Ảnh hưởng nguồn carbonhydrat đến tăng trưởng hệ sợi nấm Phục linh Kết phân tích ANOVA Ảnh hưởng nguồn carbonhydrat đến tăng trưởng hệ sợi nấm Phục linh Ảnh hưởng pH đến tăng trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh môi trường lỏng Bảng Ảnh hưởng pH đến tăng trưởng hệ sợi Bảng 10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tăng trưởng hệ sợi Bảng 11 Tóm tắt ảnh hưởng nhiệt độ đến tăng trưởng sợi nấm Bảng 12 Bảng 13 Bảng 14 Bảng 15 Bảng 16 Bảng 17 Thời gian hệ sợi xâm chiếm toàn chất mùn cưa gỗ thơng có bổ sung cám gạo Thời gian hệ sợi xâm chiếm toàn chất mùn cưa gỗ thơng có bổ sung cám bắp Thời gian hệ sợi xâm chiếm toàn chất mùn cưa gỗ thơng có bổ sung thóc luộc Thống kê kết thí nghiệm dựa vào thời gian hệ sợi lan hết 100% thể tích chất khối lượng hạch nấm Thời gian hệ sợi bao phủ 100% bề mặt gỗ khúc Số liệu phơi có chất gỗ khúc nguồn giống 100% thóc bịch nilong sau tháng kể từ ngày cấy giống Số liệu phơi có chất gỗ khúc nguồn giống phối trộn mùn Bảng 18 cưa 20% thóc luộc bịch nilong sau tháng kể từ ngày cấy giống Bảng 19 Bảng 20 Thống kê suất phôi gỗ khúc môi trường bán tự nhiên với nguồn giống 100% thóc luộc Thống kê suất phơi gỗ khúc môi trường bán tự nhiên với nguồn giống phối trộn mùn cưa 20% thóc luộc Bảng 21 Kết ANOVA suất sinh học Hình Khu vực nuôi trồng nấm Phục linh điều kiện bán tự nhiên Hình Hạch nấm Phục linh Hình Chất thịt màu trắng bên hạch nấm Phục linh Hình Quả thể đảm nấm Phục linh phát triển mặt đất Hình Cây phả hệ dựng phương pháp Neighbour Joining Hình Cây phả hệ dựng phương pháp Maximum parsimony Hình Cây phả hệ dựng phương pháp Maximum Likelihood Hình Hệ sợi nấm Phục linh phân lập từ hạch nấm Hình Câu trúc sợi nấm Phục linh độ phóng đại x40 x100 Hình 10 Hình 11 Hình 12 Hình 13 Mối quan hệ nguồn carbonhydrat - Sự tăng trưởng hệ sợi nấm Phục linh Hệ sợi nấm Phục linh phát triển mơi trường PDA có bổ sung carbohydrate – theo thứ tự M (maltose) - G (glucose) – F (fuctose) Ảnh hưởng pH đến tăng trưởng hệ sợi môi trường lỏng Hệ sợi nấm Phục linh môi trường lỏng (theo thứ tự tuần – tuần – tuần – tuần) Hình 14 Hệ sợi nấm Phục linh mơi trường lỏng Hình 15 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển sợi nấm Hình 16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển nấm Phục linh (ngày thứ 6) Hình 17 Phơi làm giống sản xuất sau ngày cấy giống Hình 18 Phơi làm giống sản xuất sau ngày cấy giống Hình 19 Phơi làm giống sản xuất sau ngày cấy giống Hình 20 Hạch nấm hình thành chất mùn cưa có bổ sung tinh bột Hình 21 Hạch nấm Phục linh hình thành chất mùn cưa Hình 22 Hạch nấm Phục linh hình thành mơi trường mùn cưa Hình 23 Hình 24 Hình 25 Hình 26 Sự phát triển hệ sợi nấm Phục linh phôi gỗ khúc thí nghiệm 3, sau cấy ngày Sự phát triển hệ sợi nấm Phục linh phôi gỗ khúc thí nghiệm 3, sau cấy ngày Sự hình thành phát triển hạch nấm Phục linh gỗ khúc thí nghiệm 3, sau tháng Hạch nấm Phục linh hình thành phát triển gỗ khúc môi trường bán tự nhiên MỤC LỤC Trang Phần MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích Yêu cầu Hạn chế đề tài Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nấm trồng 1.1 Khái quát nấm hình thái học 1.1.1 Khái quát nấm 1.1.2 Hình thái học sợi nấm 1.2 Các giai đoạn phát triển sợi nấm 1.2.1 Giai đoạn sinh trưởng 1.2.2 Giai đoạn phát triển 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên sinh trưởng hệ sợi nấm Nấm Phục linh 2.1 Khái quát chung 2.2 Đặc điểm hình thái chu trình sống nấm Phục linh 2.2.1 Đặc điểm hình thái nấm Phục linh 2.2.2 Chu trình sống nấm Phục linh 2.3 Phân bố, điều kiện sống nấm Phục linh 2.4 Hệ thống học phân tử nấm học 10 2.4.1 Trình tự rDNA 10 2.4.2 Đoạn gen mã hoá 5,8S rRNA 28S rRNA 10 2.5 Thành phần hóa học đặc tính dược lý nấm Phục linh 11 2.5.1 Triterpenes 11 2.5.2 Polysaccharides 14 2.5.3 Các hợp chất khác 15 2.6 Nuôi trồng nấm Phục linh 16 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 17 1.1 1.2 1.3 Vật liệu nghiên cứu 17 Phạm vi nghiên cứu 17 Thời gian nghiên cứu: 17 10 Phương pháp nghiên cứu 17 2.1 2.2 2.3 Phân lập giống nấm từ hạch nấm Phục linh 17 Định danh chủng giống sinh học phân tử 18 Khảo sát yếu tố sinh thái ảnh hưởng lên sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh 18 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbonhydrat lên sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh 18 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh môi trường lỏng 19 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh 19 2.4 Khảo sát số thành phần nguyên liệu chất nhân giống sản xuất nấm Phục linh 20 2.5 Khảo sát khả hình thành hạch nấm số môi trường nuôi trồng nhân tạo 21 2.5.1 Khảo sát khả hình thành hạch nấm môi trường mùn cưa 21 2.5.2 Khảo sát khả hình thành hạch nấm môi trường gỗ khúc 22 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 24 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 Kiểm tra nguồn giống 25 1.1 1.2 Giải phẫu hạch nấm 25 Phân tích đoạn ITS hệ sợi phân lập được, so sánh với kết công bố GenBank 27 1.3 Phân lập nấm Phục linh 30 Ảnh hưởng yếu tố sinh thái lên sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh 31 2.1 Ảnh hưởng nguồn carbonhydrat lên sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh 31 2.2 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh môi trường lỏng 33 2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Phục linh 36 Ảnh hưởng thành phần nguyên liệu chất nhân giống sản xuất nấm Phục linh 38 45 Bảng 17 Số liệu phơi có chất gỗ khúc nguồn giống 100% thóc bịch nilong sau tháng kể từ ngày cấy giống Giống mùn cưa có nguồn giống 100% thóc Kích thước gỗ khúc làm chất (cm) Tỉ lệ phôi hạch nấm (%) Số lượng hạch Kích thước hạch nấm trung bình nấm trung bình Đường kính (cm) Độ dày (cm) ≤20 100 1.8 3.5 2.5 20-25 100 1.6 2.9 1.8 25-30 100 2.9 2.1 30≥ 60 1.3 Bảng 18 Số liệu phơi có chất gỗ khúc nguồn giống phối trộn mùn cưa 20% thóc luộc bịch nilong sau tháng kể từ ngày cấy giống Giống mùn cưa có bổ sung 20% thóc Kích thước gỗ khúc làm chất (cm) Tỉ lệ phôi hạch nấm (%) Số lượng hạch Kích thước hạch nấm trung bình nấm trung bình Đường kính (cm) Độ dày (cm) ≤20 100 3.7 2.75 20-25 100 1.16 4.8 25-30 100 5.6 3.6 30≥ 100 1.6 3.4 2.3 Nguồn giống khác gây ảnh hưởng đến khả phát triển hạch nấm thí nghiệm Nguồn giống 20% thóc cấy gỗ khúc cho tỷ lệ xuất hạch nấm 100% tất kích thước gỗ khúc dùng làm chất Xét tác động tỷ lệ thóc, nghiệm thức nguồn giống 100% thóc luộc có tỷ lệ khơng hình thành hạch nấm Vậy kích thước gỗ khúc gây ảnh hưởng đến số lượng hạch nấm tỷ lệ hạch nấm 46 Đường kính độ dày hạch nấm tiêu đánh giá sinh trưởng hạch nấm Đường kính độ dày hạch nấm đo vị trí có đường kính độ dày lớn hạch nấm (cm) Đường kính độ dày hạch nấm to thể hạch nấm sinh trưởng tốt ngược lại Do sinh trưởng đường kính độ dày hạch nấm ảnh hưởng đến khối lượng hạch nấm Số lượng hạch nấm ảnh hưởng đến sinh trưởng đường kính độ dày hạch nấm Bảng 17, 18 cho thấy đường kính độ dày hạch nấm cao đường kính gỗ khúc 25-30cm với giống mùn cưa có bổ sung 20% thóc Như vậy, với nguồn giống 20% thóc luộc cấy gỗ khúc mơi trường gỗ khúc cho tỷ lệ hình thành hạch nấm ổn định GK1 GK2 Hình 23 Sự phát triển hệ sợi nấm Phục linh phơi gỗ khúc thí nghiệm 2, sau cấy ngày 47 GK1 GK2 Hình 24 Sự phát triển hệ sợi nấm Phục linh phơi gỗ khúc thí nghiệm sau cấy ngày GK1 GK2 Hình 25 Sự hình thành phát triển hạch nấm Phục linh gỗ khúc thí nghiệm 2, sau tháng 48 4.3 Khả hình thành hạch nấm điều kiện ni trồng bán tự nhiên Có nhiều vi sinh vật khác đất, có nhiều nhiếu tố gây hạn chế phát triển nấm điều kiện môi trường tự nhiên gây ảnh hưởng đến khả phát triển hệ sợi Để khắc phục nhược điểm này, thực nuôi trồng nấm Phục linh điều kiện bán tự nhiên trước đưa môi trường tự nhiên Tức khúc gỗ cho vào túi nilong trước cấy giống để hệ sợi phát triển hoàn toàn sau 30 ngày hệ sợi ăn sâu vào phần lõi gỗ khúc đủ mạnh mẽ để chống chọi tác nhân gây ảnh hưởng xâm lấn từ bên Qua theo dõi thu kết tỷ lệ hạch nấm số lượng hạch nấm thu nấm Phục linh chất gỗ khúc có hấp khử trùng bảng 19 20 Bảng 19 Thống kê suất phôi gỗ khúc môi trường bán tự nhiên với nguồn giống 100% thóc luộc Phơi nấm nguồn giống 100% thóc luộc Số hiệu phơi Kích thước phơi (chiều dài x chiều rộng) (cm) Hiệu suất Số lượng hạch Tổng khối lượng sinh học nấm xuất hạch nấm (g) (BE) (%) 15 × 9,5 0 12 × 40 17.0 13 × 52 10.4 13 × 304 60.8 12 × 7,9 36 6.12 15 × 10,2 0 0.0 14 × 9,9 90 8.36 522 Tổng 49 Bảng 20 Thống kê suất phôi gỗ khúc môi trường bán tự nhiên với nguồn giống phối trộn mùn cưa 20% thóc luộc Phơi nấm nguồn giống phối trộn mùn cưa 20% thóc luộc Số hiệu phơi Kích thước phơi (chiều dài x chiều rộng) (cm) Hiệu suất Số lượng hạch Tổng khối lượng sinh học nấm xuất hạch nấm (g) (BE) (%) 13 × 7,6 85 14.4 15 × 6,7 72 13.6 15 × 10,9 116 8.29 15 × 8,6 63 7.23 14 × 7,9 68 9.91 15 × 10,2 129 10.5 13 × 5,1 Tổng 404 152.2 16 937 Việc sử dụng nguồn dinh dưỡng có bổ sung tinh bột gây ảnh hưởng đến khả hình thành phát triển hạch nấm Ở nghiệm thức nguồn giống 20% thóc luộc cấy gỗ khúc cho tỷ lệ xuất hạch nấm 100% tất kích thước gỗ khúc dùng làm chất Bảng 19, 20 cho thấy đường kính độ dày hạch nấm cao đường kính gỗ khúc 25-30cm với giống mùn cưa có bổ sung 20% thóc Xét tổng thể, mức thí nghiệm mơ hình, sau loại bỏ số thô theo Dixon, bước đầu nghiệm thức (bảng kết 19 20) chưa cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê hiệu suất sinh học Nghiệm thức sử dụng tỉ lệ phối trộn mùn cưa 20% thóc cho giá trị hiệu suất sinh học trung bình ổn định nghiệm thức sử dụng 100% thóc Kết thống kê bảng 21 thấy rõ lý giải hiệu suất sinh học trung bình nghiệm thức 20 % thóc luộc (30,9) với phương sai nhỏ nghiệm thức (14,7) Nguồn giống 20% thóc luộc cấy gỗ khúc mơi trường bán tự nhiên cho giá trị suất sinh học trung bình ổn định Vậy mùn cưa gỗ thơng bổ sung tinh bột tỷ lệ 20% thóc luộc tốt để làm giống 50 Bảng 21 Kết ANOVA hiệu suất sinh học SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 100% Thóc 41,86321 14,66857 42,37186 20% Thóc + 80% mùn cưa 64,01182 30,87571 8,165876 Hình 26 Hạch nấm Phục linh hình thành phát triển gỗ khúc môi trường bán tự nhiên 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết đạt trình thực nghiệm, rút kết luận sau: - Hệ sợi nấm Phục Linh có khả phát triển tốt loại đường (Mantose, D-glucose, Frutose) khảo sát - pH6 tối ưu để nhân giống dịch thể nấm Phục linh - Hệ sợi nấm Phục linh tồn phát triển nhiệt độ 40°C - Mùn cưa gỗ thông bổ sung tinh bột tỷ lệ 20% thóc luộc tốt để làm giống - Trên môi trường chất gỗ khúc nấm Phục linh hình thành hạch nấm điều kiện nhân tạo hoàn toàn điều kiện nuôi trồng bán tự nhiên Kiến nghị Sau thực đề tài chúng tơi xin có số đề nghị sau: - Tiếp tục trồng thử nghiệm nấm Phục linh quy mơ lớn để có kết luận xác suất nấm Phục linh trồng môi trường tự nhiên Lâm Đồng - Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng tuổi sinh lý thông dùng làm nguyên liệu trồng nấm Phục linh đến suất chất lượng nấm Phục linh - Phân tích thành phần hợp chất sinh học có nấm Phục linh nuôi trồng Lâm Đồng để làm sở đánh giá so sánh chất lượng chủng nấm với giống khác giới 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002): Sinh học phân tử NXB Giáo dục Nguyễn Lân Dũng (2010), Công Nghệ Nuôi Trồng Nấm - Tập 1, 2, Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơn, Ngô Xuân Nghiễn (2005), Zani Fedirico, Nấm ăn – Cơ sở khoa học công nghệ nuôi trồng, Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Văn Lan, Đỗ Tất Lợi, Nguyễn Văn Thạch (1979), Kĩ thuật nuôi trồng chế biến dược liệu, Nhà xuất Nông nghiệp Đỗ Tất Lợi (1977) , Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Trịnh Tam Kiệt (1981), Nấm lớn Việt Nam, tập 1, 2, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Lê Duy Thắng, Trần Văn Minh (2005), Sổ tay hướng dẫn trồng nấm, Nhà xuất Nông nghiệp Tiếng Anh Akihisa T, Nakamura Y, Tokuda H, Uchiyama E, Suzuki T, Kimura Y, Uchikura K, Nishino H (2007), "Triterpene acids from Poria cocos and their anti-tumor-promoting effects," Journal of Natural Products, vol Volume 70, no Issue 06, p pages 948–953 10 Akihisa T, Uchiyama E, Kikuchi T, Tokuda H, Suzuki T, Kimura Y (2009), "Anti-tumor-promoting effects of 25-methoxyporicoic acid A and other triterpene acids from Poria cocos.," Journal of Natural Products, vol Volume 72, no Issue 10, pp pages 1786-1792 53 11 Atsumi T, Kakiuchi N, Mikage M (2007), “DNA Sequencing Analysis of ITS and 28S rRNA of Poria cocos”, Biol Pharm Bull, Vol 30, no 8, pages 1472-1476 12 Akihisa T, Mizushina Y, Ukiya.M, Osikubo M, Kondo S, Kimura Y, Suzuki T, Tai T (2004), "Dehydrotrametenonic Acid and Dehydroeburiconic Acid from Poria cocos and Their Inhibitory Effects on Eukaryotic DNA Polymerase α and β.," Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, vol 62, no 2, pp pages 448-450 13 Chang H.M, Butt P.P.H.( 1986), Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica., Singapore: World Scientific, pages 875 – 877 14 Chihara G, Hamuro J, Maeda Y, Arai Y, Fukuoka F (1970), "Antitumor polysaccharide derived chemically from natural glucan (pachyman).," Nature, vol volume 225, p pages 943–944 15 Cooke R C, Whipps J M (1993), Ecophysiology of fungi, Oxford, Boston: Blackwell Scientific 16 Esteban C.I (2009), "Medicinal interest of Poria cocos (= Wolfiporia extensa).," Revista Iberoamericana de Micología, vol Volume 26, no Issue 2, pp Pages 103-107 17 Feng Y.L, Lei P, Tian T, Yin L, Chen D.Q, Chen H, Mei Q, Zhao Y.Y, Lin R.C (2013), " Diuretic activity of some fractions of the epidermis of Poria cocos.," Journal of Ethnopharmacology., vol Volume 150, no Issue 3, pp Pages 1114-1118 18 Julian I, Mitchell, Peter J Roberts, Stephen T Moss (1995), "Sequence or Structure?: A short review on the application of nucleic acid sequence information to fungal taxonomy, Mycologist”, Volume 9, Part 2, Pages 67-75 19 Jo W.S, Yoo Y.B, Hong I.P and Kim D.G (2013), "Changes of the cultivation methods of Poria cocos and its commercialization.," Journal 54 of Mushroom Science and Production , vol Volume 11 , no Issue 4, pp pages 303-307 20 Li G, Xu M.L, Lee C.S, Woo M.H, Chang H.W, Son J.K (2004), "Cytotoxicity and DNA topoisomerases inhibitory activity of constituents from the sclerotium of Poria cocos.," Arch Pharm Res, vol 27, no 8, pp pages 829-833 21 Hsu H.Y, Chen Y.P, Shen S.J, Hsu C.S, Chen C.C, Chang H.C (1986), "Oriental Materia Medica: A Concise Guide.," 1945 Palo Verde Ave., Suite 208, Long Beach, CA, p pages 305 – 306 22 Huang.Q, Zhang L (2005), "Solution properties of (1 → 3)-α-D-glucan and its sulfated derivative from Poria cocos mycelia via fermentation tank.," Biopolymers, vol 79, no 1, pp pages 28-38 23 Ha Thi Hoa, Wang C.L (2015), “The effect of temperature and nutritional conditions on mycelium growth of oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus and Pleurotus cystidionsus)”, Mycobiology,43, pp.14-23 34 Elisashvili V.I(2012), "Submerged Cultivation of Medicinal Mushrooms: Bioprocesses and Products (Review)," International Journal of Medicinal Mushrooms, vol 14, no 3, pp 211 - 239 45 Jin Y, Zhang L, Chen L, Chen Y, Cheung P.C K, Chen L (2003), "Effect of culture media on the chemical and physical characteristics of polysaccharides isolated from Poria cocos mycelia," Carbohydrate Research, vol 338, no 14, pp Pages 1507-1515 26 Kanayama H, Adachi N, Togami M (1983), "A new antitumor polysaccharide from the mycelia of Poria cocos wolf .," Chemical and Pharmaceutical Bulletin , vol Volume 31 , no Issue , pp Pages 11151118 27 Kobira S, Atsumi T, Kakiuchi N, Mikage M (2012), "Difference in cultivation characteristics and genetic polymorphism between Chinese and Japanese strains of Wolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson (Poria 55 cocos Wolf)," Journal of Natural Medicines, vol volume 66, p pages 493–499 28 Kibar Pekşen (2012), “Sclerotia Obtained from Mushrooms and Its Use as Functional”, Horticulture, vol 2, Iss 3, p23-36 29 Nukaya.H, Yamashiro H, Fukazawa H, Ishida H, Tsuji K (1996), "Isolation of inhibitors of TPA-induced mouse ear edema from Hoelen, Poria cocos.," Chemical & Pharmaceutical Bulletin, vol 44, no 4, pp pages 847-849 30 Miles.P.G,Chang.S.T (1997), “Mushroom biology: concise basics and curent developments”, World Scientific 31 Ríos J.L (2011), "Chemical Constituents and Pharmacological Properties of Poria cocos.," Planta Medica , vol Volume 77, no Issue 07, p pages 681–691 32 Sun, Yichun (2014), "Biological activities and potential health benefits of polysaccharides from Poria cocos and their derivatives," International Journal of Biological Macromolecules, vol vol 68, pp pages 131-134 33 Shingu.T, Tai T, Akahori A (1992) , "A lanostane triterpenoid from Poria cocos.," Phytochemistry , vol Volume 31, no Issue 7, pp Pages 25482549 34 Tai T, 1991), Akahori A, Shingu.T (1991), "Triterpenoids from Poria cocos.," Phytochemistry , vol Volume 30, no Issue 8, pp pages 27962797 35 Tai T, Akahori A, Shingu.T (1993), " Triterpenes of Poria cocos.," Phytochemistry , vol Volume 32, no Issue 5, pp Pages 1239-1244 36 Tai T, Shingu.T, Kikuchi T, Tezuka Y, Akahori A (1995a), "Triterpenes from the surface layer of Poria cocos.," Phytochemistry , vol Volume 39, no Issue 5, pp Pages 1165-1169 37 Tai T, Shingu.T, Kikuchi T, Tezuka Y, Akahori A (1995b), "Isolation of lanostane-type triterpene acids having an acetoxyl group from sclerotia 56 of Poria cocos.," Phytochemistry, , Vols Volume 40, , no Issue 1, pp Pages 225-231 38 Tai T, Akita Y, Kinoshita K, Koyama K, Takahashi K, Watanabe K (2007), "Anti-Emetic Principles of Poria cocos.," Planta Medica, vol Volume 61, no Issue 06, pp pages 527-530 39 Ukiya.M, Akihisa T, Tokuda H, Hirano M, Oshikubo M, Nobukuni Y, Kimura Y, Tai Y, Kondo S, Nishino H (2002), "Inhibition of tumorpromoting effects by poricoic acids G and H and other lanostane-type triterpenes and cytotoxic activity of poricoic acids A and G from Poria cocos.," Journal of Natural Products, vol Volume 65, no Issue 04, p pages 462–465 40 Wang Y, Zhang M, Ruan D, S.Shashkov A, Kilcoyne M, V.Savage A, Zhang L (2004), "Chemical components and molecular mass of six polysaccharides isolated from the sclerotium of Poria cocos," Carbohydrate Research, vol 339, no Issue 2, pp Pages 327-334 41 Yokoyama A, Natori S, Aoshima K (1975), "Distribution of tetracyclic triterpenoids of lanostane group and sterols in the higher fungi especially of the polyporaceae and related families.," Phytochemistry , vol Volume 14, no Issue 2, pp Pages 487-497 42 Yasukawa.K, Kaminaga T, Kitanaka S, Tai T, Nunoura Y, Natori S, et al (1998) , "3 beta-p-hydroxybenzoyldehydrotumulosic acid from Poria cocos, and its anti-inflammatory effect.," Phytochemistry , vol 48, pp 1357-1360 43 Yang F.C, Liau C.B (1998), "Effects of cultivating conditions on the mycelial growth of Ganoderma lucidum in submerged flask cultures," Bioprocess Engineering, vol 19, p 233–236 44 Zhao Y.Y, Feng Y.L, Bai X, Tan X.J, Lin R.C, Mei Q (2013), "Ultra Performance Liquid Chromatography-Based Metabonomic Study of Therapeutic Effect of the Surface Layer of Poria cocos on AdenineInduced Chronic Kidney Disease Provides New Insight into Anti- 57 Fibrosis Mechanism," PLOS ONE (www.plosone.org), vol 8, no Issue 3, p e59617 45 Zheng.Y, Yang X.W (2008), "Absorption of triterpenoid compounds from Indian bread (Poria cocos) across human intestinal epithelial (Caco-2) cells in vitro.," Zhongguo Zhong Yao Za Zhi , vol 33, p pages 1596– 1601 46 Zheng.Y, Yang X.W (2008a), "Two new lanostane triterpenoids from Poria cocos.," Journal of Asian Natural Products Research, vol Volume 10, no Issue , pp Pages 289-292 47 Zheng.Y, Yang X.W (2008b), "Poriacosones A and B: two new lanostane triterpenoids from Poria cocos.," Journal of Asian Natural Products Research., vol Volume 10, no Issue 7, pp Pages 640-646 Tài liệu internet 48 https://vi.wikipedia.org/wiki/Wolfiporia 58 PHỤ LỤC Quy trình sản xuất nấm Phục linh Bước 1: Xử lý nguyên liệu trồng nấm Cành nhánh gỗ thông tỉa thưa rừng sau thu thập về, chọn gỗ thơng cịn trắng có độ tuổi từ đến năm, để tránh bị nhiễm loại nấm vi sinh vật có hại khác Sau đó, gỗ thơng phân loại mang nghiền thành bột cắt khúc Xử lý mùn cưa gỗ thơng: mùn cưa cịn tươi không bị thấm nước, không lẫn mùn cưa gỗ khác chưa xuất nấm mốc côn trùng Mùn cưa bổ sung nước từ từ trộn dùng tay bóp nhẹ có nước rỉ giọt kẽ ngón tay đủ độ ẩm (độ ẩm khoảng 70%) Gỗ khúc: cành thơng ba rừng Đà Lạt có độ tuổi từ 6-9 năm Vì thơng ba Đà Lạt bảo tồn chặt chẽ nên việc lựa chọn mẫu gỗ thơng để làm thí nghiệm hạn chế Mục tiêu thí nghiệm khảo sát hình thành thể tơi tận dụng cành thơng với kích thước chưa đồng để tiến hành thí nghiệm Gỗ thơng thu thập vào tháng 12, thời điểm giai đoạn phát triển mạnh thơng Mục đích bước xử lý nguyên liệu tạo điều kiện cho vi sinh vật có lợi hoạt động, phân giải phần chất Bước 2: Đóng bịch hấp nguyên liệu Dùng túi nilong có khả chịu nhiệt, chứa 0,5 kg nguyên liệu để đóng bịch Nguyên liệu đóng vào bịch có độ ẩm từ 65-70% Sử dụng đoạn ống nhựa làm cổ túi kéo miệng túi nilong qua ống nhựa dùng nút bơng làm nút Sau đóng bịch ngun liệu đem hấp khử trùng lị hấp có nhiệt độ 121°C, 1atm thời gian 60 phút Bước 3: Cấy giống Sau hấp, bịch chất để nguội Phôi cách ly ngày để đảm bảo rủi ro khách quan trình xử lý chất làm bịch hấp khử trùng, phơi có dấu hiệu nhiễm khuẩn hay nhiễm nấm mốc bị loại bỏ Cấy giống nấm Phục linh nuôi môi trường mùn cưa gỗ khúc chuẩn bị trước, phơi cấy 50g chất có chứa giống nấm 59 Khi cấy giống, tháo nút sau cấy lượng giống theo cơng thức khác vào phía mặt bịch chất (hạn chế làm tổn thương sợi nấm giống) Sau cấy giống lại tiếp tục đậy nút vào miệng túi Bước 4: Ươm sợi Bịch nấm sau cấy giống ươm nhà ươm, để giá để xuống đất theo chiều nút hướng lên phía Các phơi cấy giống xong ủ điều kiện hạn chế ánh sáng nhiệt độ phòng nhà ươm (khoảng 25± 2°C) Nhà ươm bịch nấm thoáng mát, sẽ, độ ẩm từ 70-75% Trong q trình ươm khơng tưới nước trực tiếp vào bịch nấm mà tưới Đồng thời nhà ươm cần đảm bảo khơng có chuột, khơng chúng cắn bịch nấm Thường xuyên theo dõi để phát bịch nấm bị nhiễm nấm hại, tách riêng bịch nhiễm nấm hại (trong giới hạn cho phép 810%) Nếu bị nhiễm nhiều bỏ hồn tồn để tránh khơng lây sang bịch khác Thời gian ươm nấm Phục linh 30 ngày, sợi nấm phát triển lan sâu vào nguyên liệu tạo nên màu trắng đồng Bước 5: Chăm sóc thu hái Khi hạch nấm bắt đầu mọc ra, tiến hành tưới xung quanh nhà, khơng tưới trực tiếp vào bịch dùng bình phun sương để tạo độ ẩm quanh tường nhà trồng nấm Sau 40 – 60 ngày, bắt đầu hình thành hạch nấm nhỏ Giai đoạn trì nhiệt độ độ ẩm vườn ươm bước Sau khoảng tháng tiến hành thu hái hạch nấm loại bỏ bịch chất