Bước đầu tách và nuôi cấy tiểu đảo langerhans từ chuột nhắt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ KIM ANH BƯỚC ĐẦU TÁCH VÀ NUÔI CẤY TIỂU ĐẢO LANGERHANS TỪ CHUỘT NHẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ KIM ANH BƯỚC ĐẦU TÁCH VÀ NUÔI CẤY TIỂU ĐẢO LANGERHANS TỪ CHUỘT NHẮT NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 8720205 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu thông tin luận văn trung thực, xác chưa công bố nghiên cứu khác Tác giả luận văn Lê Thị Kim Anh TĨM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2019 – 2021 Chuyên ngành: Dược lý dược lâm sàng BƯỚC ĐẦU TÁCH VÀ NUÔI CẤY TIỂU ĐẢO LANGERHANS TỪ CHUỘT NHẮT Lê Thị Kim Anh GVHD: PGS TS Đỗ Thị Hồng Tươi Mở đầu: Đái tháo đường nguyên nhân gây tử vong cho người bệnh, liên quan biến chứng tim mạch, thận, mắt, chi, Hiện nay, mơ hình gây tổn thương tiểu đảo tụy phân lập từ chuột sử dụng nghiên cứu sàng lọc, phát triển nguyên liệu/sản phẩm có khả phịng và/hoặc điều trị bệnh đái tháo đường Tuy nhiên, báo cáo phân lập tiểu đảo Langerhans Việt Nam cịn hạn chế Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu “Bước đầu tách nuôi cấy tiểu đảo Langerhans từ chuột nhắt” Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Tụy chuột nhắt chủng Swiss albino ủ với enzym collagenase 37 oC 15, 20, 25, 30 phút Các tiểu đảo thu nhận phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng nuôi ổn định môi trường RPMI 1640, bổ sung 10% FBS 1% penicillin/streptomycin 37 oC, 5% CO2 24, 48, 72 với mật độ 70, 100, 130, 160 tiểu đảo/giếng Dựa hình thái, số lượng, tỷ lệ tế bào sống khả tiết insulin tiểu đảo, đề tài chọn thông số ảnh hưởng quy trình phân lập thích hợp Các tiểu đảo Langerhans sau phân lập nuôi ổn định, xử lý với glucose nồng độ 20 mM 30 mM 24, 48, 72 giờ, đánh giá hình thái tỷ lệ tế bào sống để chọn mơ hình in vitro gây tổn thương tiểu đảo thích hợp i Kết quả: Tụy chuột ủ với enzym collagenase 30 phút 37 oC, tiểu đảo phân lập nuôi ổn định đĩa giếng mật độ 100 tiểu đảo/giếng/3 ml môi trường (tương ứng 11 tiểu đảo/cm2) 24 Xử lý tiểu đảo tụy với glucose nồng độ 30 mM 72 giảm 49,45% tỷ lệ tế bào sống, nồng độ insulin khác biệt không đáng kể so với mẫu sinh lý môi trường glucose 2,8 mM Thuốc đối chứng dương glimepirid nồng độ 10 µM giảm 62,73% tỷ lệ tế bào sống, nồng độ insulin thấp 1,01 – 1,09 lần so với sinh lý Kết luận: Tiểu đảo Langerhans phân lập từ chuột nhắt Swiss albino nuôi ổn định mật độ 11 tiểu đảo/cm2 24 trước tiến hành thử nghiệm khác Việc nuôi cấy môi trường glucose 30 mM 72 gây độc tính tiểu đảo Langerhans, chủ yếu ảnh hưởng đến khả sống tế bào, không tác động nhiều đến tiết insulin tế bào β Từ khóa: Tiểu đảo Langerhans, glucose nồng độ cao, in vitro, Swiss albino, đái tháo đường ABSTRACT Master's thesis – Academic course 2019 – 2021 Speciality: Pharmacology and clinical pharmacology FIRST STEPS OF ISOLATION AND CULTURE LANGERHANS ISLET FROM MICE Le Thi Kim Anh Supervisor: Assoc Prof Dr Do Thi Hong Tuoi Introduction: Diabetes can be a cause of death for patients, related to complications of cardiovascular, kidney, eye, limb Currently, models of injury pancreatic islet isolated from mice are used in research, screening and development of materials/products with the potential to prevent and/or treat diabetes However, reports on isolation of Langerhans islets in Viet Nam are still limited Therefore, this study conducted "First steps of isolation and culture of Langerhans islets from mice" Materials and Methods: Swiss albino mice pancreas was incubated with collagenase enzyme at 37 oC for 15, 20, 25, 30 minutes The islets were collected by density gradient centrifugation and stabilized in RPMI 1640 medium, supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin at 37 °C, 5% CO2 for 24, 48, and 72 h with density 70, 100, 130, 160 islets/well Based on the morphology, number, percentage of cell viability and insulin secretion ability of the islets, the study selected the parameters affecting the isolation process Langerhans islets after isolation and stable culture, were treated with glucose concentration of 20 mM or 30 mM for 24, 48, 72 hours This study evaluated morphology and percentage of cell viability to choose an in vitro model to cause injure islet Results: The pancreas was incubated with collagenase enzyme for 30 minutes at 37 oC, the islets were stably grown in a 6-well plate at a density of 100 islets/well/3 ml of medium (corresponding to 11 islets/cm2) in 24 hours Treating pancreatic islets with glucose concentration of 30 mM for 72 hours reduced survival rate by 49,45%, insulin concentration was not significantly different from physiological samples in 2,8 mM glucose medium The positive control drug glimepiride with concentration of 10 µM reduced 62,73% the percentage of cell viability, and insulin concentration was 1,01 – 1,09 times lower than physiological Conclusion: Langerhans islets isolated from Swiss albino mice were stabilized at a density of 11 islets/cm2 for 24 hours before conducting other experiments Culture in 30 mM glucose for 72 hours caused toxicity in the islets of Langerhans, mainly affecting cell viability, but not much effect on insulin secretion of β-cells Keywords: islet of Langerhans, high glucose concentration, in vitro, Swiss albino, diabetes i MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đái tháo đường 1.2 Tổng quan tụy 1.3 Một số mơ hình điều trị đái tháo đường gây tổn thương tế bào β 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Khảo sát số thơng số ảnh hưởng quy trình phân lập tiểu đảo Langerhans từ chuột nhắt 32 3.2 Khảo sát nồng độ glucose gây độc tiểu đảo Langerhans 42 CHƯƠNG BÀN LUẬN 47 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 i TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BSA Bovin serum albumin Albumin huyết bò FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bò GLP - Glucagon – like peptide HbA1c Hemoglobin A1c Hemoglobin A1c HDL High Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao LDL Low Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl tetrazolium 2,5-diphenyl bromid) bromid) OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate buffered saline Đệm phosphat PP Pancreatic polypeptide Polypeptid tụy tetrazolium Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Bảng kết số lượng tiểu đảo trạng thái (khỏe mạnh, thối hóa hoại tử) với mật độ nuôi ổn định khảo sát Mật độ 24h 48h 72h Tiểu đảo khỏe mạnh Tiểu đảo thối hóa Tiểu đảo hoại tử Tiểu đảo khỏe mạnh Tiểu đảo thối hóa Tiểu đảo hoại tử Tiểu đảo khỏe mạnh Tiểu đảo thối hóa Tiểu đảo hoại tử 70 tiểu đảo/ giếng 100 tiểu đảo/ giếng 130 tiểu đảo/ giếng 160 tiểu đảo/ giếng 15 48 53 58 41 63 69 16 21 17 10 59 35 28 76 102 88 108 91 123 2 38 15 34 37 58 30 24 17 19 21 26 20 33 45 44 61 66 75 32 20 54 24 28 19 13 13 11 18 15 16 9 12 0 34 37 53 63 76 27 24 18 10 21 21 17 29 15 61 104 107 120 158 156 138 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 90 104 71 133 125 137 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Bảng kết khảo sát tỷ lệ sống tế bào sau – 72 nuôi ổn định OD550nm 0h 24 48 72 0,224 0,197 0,214 0,175 0,285 0,235 0,203 0,174 0,238 0,224 0,223 0,197 0,227 0,184 0,176 0,147 0,259 0,211 0,198 0,181 0,263 0,225 0,194 0,172 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Bảng kết khảo sát tác động glucose nồng độ cao lên tỷ lệ sống tế bào sau 24 – 72 tiếp xúc 24 Mẫu OD 550nm Sinh lý (glucose mM) 0,186 0,203 0,189 0,183 0,215 0,187 Nồng độ 20 mM glucose 30 mM 0,192 0,197 0,168 0,188 0,172 0,189 0,155 0,212 0,167 0,164 0,210 0,175 48 Mẫu Sinh lý (glucose mM) Nồng glucose OD 550nm 0,164 0,186 0,179 0,193 0,188 0,185 độ 20 mM 0,161 0,174 0,180 0,187 0,148 0,162 30 mM 0,153 0,175 0,176 0,147 0,165 0,164 72 Mẫu OD 550nm Sinh lý (glucose mM) 0,144 0,152 0,143 0,141 0,161 0,135 Nồng độ 20 mM glucose 30 mM 0,103 0,123 0,127 0,122 0,125 0,122 0,100 0,115 0,102 0,107 0,114 0,077 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Bảng kết khảo sát tác động glucose nồng độ cao thuốc glimepirid liều 10 µmol/l lên tỷ lệ sống tế bào sau 72 tiếp xúc Mẫu OD 550nm Sinh lý (glucose mM) 0,143 0,147 0,157 0,151 0,146 0,141 Chứng bệnh (glucose 30 mM) 0,11 Chứng dương glimepirid) 0,087 0,093 (glucose + Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 0,096 0,094 0,098 0,103 0,112 0,09 0,085 0,096 0,089 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Bảng kết khảo sát chức tiết insulin tế bào β nồng độ protein sau 24 – 72 nuôi ổn định Nồng độ insulin (µIU/ml) glucose 2,8 mM 24 1281,89 1252,80 1421,39 48 1293,50 1202,11 1187,39 72 1325,39 1199,81 1164,68 Nồng độ insulin (µIU/ml) glucose 16,7 mM 24 1381,75 1345,98 1356,08 48 1194,79 1197,50 1265,91 72 1209,36 1281,21 1230,67 Nồng độ protein (mg/ml) 24 0,173 0,162 0,175 48 0,175 0,162 0,160 72 0,184 0,167 0,167 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Bảng kết khảo sát tác động glucose nồng độ cao thuốc glimepirid liều 10 µM chức tiết insulin tế bào β nồng độ protein sau 72 tiếp xúc Nồng độ insulin (µIU/ml) glucose 2,8 mM Sinh lý 870,76 895,22 866,78 Glucose 30 mM 866,16 950,22 844,06 745,72 808,43 799,58 Glucose 30 mM + glimepirid 10 µM Nồng độ insulin (µIU/ml) glucose 16,7 mM Sinh lý 880,45 859,95 793,46 Glucose 30 mM 924,38 835,91 919,12 807,38 809,48 824,92 Glucose 30 mM + glimepirid 10 µM Nồng độ protein (mg/ml) Sinh lý 0,173 0,186 0,152 Glucose 30 mM 0,162 0,181 0,188 0,160 0,177 0,160 Glucose 30 mM + glimepirid 10 µM Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn