Chương 1: CƠ SỞ LÍ THUYẾT CHUNG VỀ TÁCH SẮC KÝ

Chương 1: CƠ SỞ LÍ THUYẾT CHUNG VỀ TÁCH SẮC KÝ

1 Chương 1: CƠ SỞ LÍ THUYẾT CHUNG VỀ TÁCH SẮC KÝ 1.1 Giới thiệu phương pháp 1.1.1 Định nghĩa sắc kí (Chromatography) Định nghĩa Mikhail S Tsvett (1906): Sắc kí phương pháp tách cấu tử hỗn hợp tách cột hấp thụ đặt hệ thống chảy Định nghĩa IUPAC (1993): Sắc kí phương pháp tách cấu tử tách phân bố hai pha, hai pha pha tĩnh đứng yên pha chuyển động theo hướng xác định 1.1.2 Phân loại Người ta phân loại phương pháp sắc kí dựa vào chế hoạt động sắc kí: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion… vào tính chất pha tĩnh phương pháp thể sắc kí Ví dụ: - Phương pháp sắc kí lỏng rắn cột, phương pháp sắc kí phân bố khí lỏng cột - Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng phẳng hai chiều - Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng pha ngược áp suất cao cột… Cơ chế sắc kí có nhiều để thực q trình sắc kí có hai dạng: dạng cột dạng phẳng (bản kính, polime, kim loại, giấy) Trong sắc kí cột, pha tĩnh giữ cột ngắn pha động cho chuyển động qua cột áp suất trọng lực Trong sắc kí mỏng, pha tĩnh phủ mặt phẳng thủy tinh kim loại Thường để đơn giản hóa, khơng xác người ta gọi tắt phương pháp sắc kí: sắc kí khí, sắc kí lỏng, sắc kí lỏng cao áp, sắc kí lớp mỏng, sắc kí gel… Trong số phương pháp sắc kí biết, quan trọng sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố sắc kí trao đổi ion Dưới giới thiệu ba phương pháp sắc kí nhằm vào hai mục đích: chuẩn bị mẫu cho chất phân tích phân tích hỗn hợp chất Bảng 1: Phân loại phương pháp sắc kí cột Phân loại chung Sắc kí lỏng (LC) (Pha động : lỏng) Phương pháp cụ thể - Lỏng- lỏng phân bố - Pha lỏng liên kết - Lỏng-rắn hấp phụ trao đổi ion Bùi Xuân Vững Pha tĩnh - Lỏng phủ chất rắn - Chất hữu gắn bề mặt rắn - Rắn Nhựa trao đổi ion Kiểu cân - Phân bố - Phân bố chất lỏng bề mặt liên kết - Hấp phụ Trao đổi ion Cơ sở phân tích sắc ký Sắc kí khí (GC) (pha động: Khí) - Khí-lỏng - Khí - pha liên kết Sắc kí lỏng siêu tới hạn - Khí - rắn Pha lỏng: chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid) - Lỏng phủ chất rắn - Chất hữu liên kết bề mặt rắn - Rắn Chất hữu liên kết bề mặt rắn - Phân bố khí lỏng - Phân bố lỏng bề mặt liên kết - Hấp phụ Phân bố chất lỏng siêu tới hạn bề mặt liên kết Pha động Mẫu Lớp mỏng pha tĩnh Bản mỏng trơ Điểm đến dung môi Pha tĩnh Hướng chảy pha động Các cấu tử tách Nồng độ B Hướng chảy pha động Sắc kí đồ Các cấu tử giải tách Mẫu (A+B+C) Xuất phát Detector Pha động Hình 1.1: Sơ đồ ngun tắc a) sắc kí cột b) sắc kí mỏng 1.2 Cơ sở lí thuyết chung phương pháp sắc kí 1.2.1 Q trình sắc kí Sắc kí kỹ thuật tách cấu tử cần tách hỗn hợp mẫu vận chuyển pha động qua pha tĩnh Mẫu vào tướng động mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố khắp Pha động pha lỏng khí, pha tĩnh lớp phim phủ bề mặt chất mang trơ bề mặt rắn Sự tương tác xảy cấu tử với pha tĩnh nhờ cấu tử phân bố pha động pha tĩnh Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Sự lực khác chất tan pha tĩnh làm chúng di chuyển với vận tốc khác pha động hệ thống sắc kí Kết chúng tách thành dải pha động vào lúc cuối trình cấu tử theo trật tự tương tác với pha tĩnh Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh sau dạng đỉnh (pic) tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí hiển thị dạng sắc kí đồ Hình 1.1 minh họa q trình tách hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A B (lực tương tác với pha tĩnh A < B) theo thời gian Mẫu chứa A B tiêm vào cột Khi cho chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần mẫu hòa tan pha động di chuyển phần đầu cột (tại thời điểm to) Ở cấu tử A B tự phân bố hai pha Tiếp tục cho pha động qua cột đẩy phần hòa tan chạy xuống phân bố pha động pha tĩnh xảy (thời điểm t1) Đồng thời phân bố dung môi pha tĩnh diễn vị trí mẫu lúc đầu Việc thêm tiếp dung mơi mang phân tử hịa tan chạy xuống cột loạt liên tiếp chuyển biến hai pha Bởi di chuyển chất tan xảy pha động, nên tốc độ trung bình di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan nằm pha Phần thời gian nhỏ chất tan bị lưu giữ mạnh pha tĩnh (cấu tử B ví dụ trên) lớn chất tan (cấu tử A) có lưu giữ pha động mạnh Sau thời gian phân tử chất A B tách khỏi Nếu đặt detectơ có khả phát chất tan (cấu tử A B) cuối cột tách tín hiệu vẽ lại hàm thời gian (hoặc thể tích thêm vào) loạt pic đối xứng ghi lại gọi sắc kí đồ Vị trí pic theo thời gian dùng để nhận diện định tính diện tích píc dùng cho phép phân tích định lượng cấu tử xét Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Mẫu Pha động Cột nhồi Detector Sắc kí đồ Thời gian Hình 1.2: Q trình tách sắc kí cột hai chất A B 1.2.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí Để thực tách sắc kí người ta sử dụng ba phương pháp sau: 1.2.2.1 Phương pháp rửa giải Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phương pháp sắc kí Một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu giới thiệu vào cột với pha động có lực với pha tĩnh bé so với cấu tử cần tách có mẫu Vì cấu tử cần tách di chuyển Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký với tốc độ chậm so với chất rửa giải Tốc độ xác định lực tương đối cấu tử lên pha tĩnh so với pha động, hệ số phân bố K = Csp/Cmp Ở Csp, Cmp nồng độ cấu tử xét pha tĩnh pha động Các cấu tử rửa giải theo trật tự lực chúng tốc độ di chuyển tương đối chúng phụ thuộc vào tương tác thành phần chúng với pha động, với pha tĩnh pha động với pha tĩnh Bởi cấu tử tách khỏi với vùng pha động chúng nên phương pháp sử dụng phép tách với mục đích phân tích Pha động khơng thay đổi thành phần dung mơi suốt q trình rửa giải; thay đổi dung môi rửa giải sau thời gian định trước (rửa giải theo giai đoạn); khơng thay đổi dung môi tạo nên pha động thay đổi nồng độ thành phần có pha động sau thời gian định trước (rửa giải gradient) 1.2.2.2 Phương pháp tiền lưu Hỗn hợp cần tách gồm chất A, B C cho chảy liên tục vào phần cột, A cấu tử có lực yếu với pha tĩnh Do cấu tử A, B C bị lưu giữ cột, nên trước hết từ cột chảy có dung mơi A có lực tương tác cột yếu di chuyển xuống cịn cấu tử có lực mạnh A bị pha tĩnh giữ phần cột Do dung dượng có hạn pha tĩnh nên vượt dung lượng cấu tử A di chuyển dọc theo cột khỏi cột dạng nguyên chất sau hỗn hợp thành phần A+B A+B+C Phương pháp tiền lưu dùng khơng thực việc tách hồn toàn cấu tử, đặc biệt sử dụng tách sắc kí vào mục đích phân tích 1.2.2.3 Phương pháp đẩy: Mẫu cho vào cột, dùng dung mơi rửa giải có lực với pha tĩnh mạnh cấu tử hỗn hợp tách để đẩy cấu tử cần tách thoát khỏi cột Cấu tử thoát khỏi cột cấu tử tương tác yếu với pha tĩnh, sau đến cấu tử khác có lực với pha tĩnh tăng dần Phương pháp tạo nên dải rửa giải khơng hồn tồn tách khỏi nhau: có dải thu chất nguyên chất có dải dải nguyên chất gồm hỗn hợp chúng Trong thực hành phịng thí nghiệm để tách hỗn hợp phức tạp người ta thường hay dùng phương pháp rửa giải Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Dung mơi rửa giải (E) Pha tĩnh Rửa giải Tiền lưu Thế đẩy Đến Detector Tín hiệu Detector Thể tích dung mơi rửa giải Hình 1.3: Các phương pháp rửa giải, tiền lưu, đẩy 1.2.3 Đặc tính sắc kí chất tan 1.2.3.1 Tính chất lưu giữ Tính chất lưu giữ phản ánh phân bố chất tan pha tĩnh pha động biểu thị đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu Thể tích lưu VR thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời điểm đưa mẫu vào, qua cột đến detectơ (trên sắc kí đồ điểm cực đại pic) Thời gian lưu tRi thời gian từ lúc chất tan i nạp vào cột tách phận tiêm mẫu lúc chất khỏi cột thời điểm có nồng độ cực đại Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Thể tích lưu nhận trực tiếp từ thời gian lưu tR sắc kí đồ cách nhân với tốc độ thể tích dịng Fc (thể tích pha động đơn vị thời gian): VR = tR Fc Tốc độ dòng tính theo thơng số cột sau: Fc d c2 t L tM Ở đây:    dc đường kính cột, L chiều dài cột, εt độ rỗng toàn phần chất nhồi cột (độ rỗng chất nhồi cột biểu thị tỉ số thể tích kẽ hở chất nhồi thể tích khối tồn phần nó: chất nhồi rắn = 0.35 - 0.45, chất nhồi xốp = 0.70 - 0.90, cột mao quản = 1.0),  Vc thể tích bên cột L Tốc độ tuyến tính trung bình u dịch chuyển chất tan là: u tR Tốc độ tuyến tính trung bình u pha động là: u L tM Ở tM hay to thời gian không bị lưu giữ chất tan (thời gian chất tan lưu pha động) Trong sắc kí khí, tM lấy thời gian cần thiết cho CH4 di chuyển qua cột Tương ứng tM hay to tích VM (hoặc Vo) biểu thị thể tích trống cột (bao gồm thể tích phận tiêm mẫu (injector), thể tích đoạn ống nối, thể tích rỗng cột thể tích detectơ) Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R thời gian lưu hiệu chỉnh t’R cho bởi: V’R = VR –VM t’R = tR – tM (thời gian không bị lưu giữ chất tan gần xem thời gian lưu pha động) Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Cường độ tín hiệu Detector Tiêm mẫu Thời gian (thể tích) Hình 1.4: Sắc kí đồ minh họa thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) độ rộng đáy pic W chất tan không bị lưu giữ M chất bị lưu giữ 1.2.3.2 Hệ số phân bố K (Partition coefficient) Mỗi cấu tử chất tan phân bố pha với cân thiết lập tất q trình tách sắc kí dựa khác khả phân bố chất tan pha động pha tĩnh Khi chất tan vào hệ thống sắc kí, phân bố pha động pha tĩnh Giả thiết pha động dừng lại vào thời gian nào, chất tan có phân bố cân hai pha, nồng độ chất tan pha cho hệ số phân bố nhiệt động: K Cs CM Ở Cs CM nồng độ chất tan pha tĩnh pha động tương ứng Trường hợp K = chất tan phân bố hai pha Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình vùng chất tan (chính xác tâm vùng) pha động vận chuyển qua cột Đối với pic đối xứng, cực đại pic xuất lối cột, nửa lượng chất tan rửa khỏi cột thể tích lưu VR nửa cịn lại phân bố thể tích pha động VM thể tích pha tĩnh Vs: VRCM = VMCM + VsCs Bùi Xuân Vững hay VR = VM + KVs hay VR – VM = KVs Cơ sở phân tích sắc ký Phương trình với cột phân bố lỏng, cột hấp phụ, Vs phải thay Ss diện tích bề mặt chất hấp thụ 1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’ (The capacity factor) Hệ số dung lượng k’ thông số thực nghiệm quan trọng sắc kí cột sử dụng rộng rải để mô tả tốc độ dịch chuyển chất tan cột Cho chất tan, hệ số dung lượng k’ định nghĩa tỉ số mol chất tan pha tĩnh số mol chất tan pha động: k’ = CsVs C M VM K Vs VM Tỉ số VM/Vs gọi tỉ số thể tích pha Hệ số dung lượng định nghĩa tỉ số thời gian chất tan lưu lại pha tĩnh thời gian cần để chất tan di chuyển pha động suốt chiều dài cột không bị lưu giữ tM k' t R' tM tR tM tM VR VM VM Khi k’ cho chất tan nhỏ nhiều, rửa giải xảy nhanh nên việc xác định thời gian lưu khó Cịn k’ khoảng 20 đến 30 thời gian rửa giải bị kéo dài Vì phép tách nên thực điều kiện mà k’ chất tan nằm khoảng giá trị từ đến Giá trị k’ sắc kí khí thay đổi việc thay đổi nhiệt độ cách nhồi cột Cịn sắc kí lỏng, k’ thường điều khiển phép tách tốt thay đổi thành phần pha động pha tĩnh 1.2.3.4 Hệ số chọn lọc (The selectivity factor) Khả pha tĩnh tách cấu tử A B (B cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn) xác định tỉ số phân bố tương đối chúng hệ số lưu giữ chúng pha tĩnh cho Hệ số chọn lọc α hàm lưu giữ tương đối cấu tử pha tĩnh: t R' t R' Bùi Xuân Vững k B' k A' KB KA Cơ sở phân tích sắc ký 10 Hệ số chọn lọc cặp dải (pic) gần hàm phụ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng, pha động nhiệt độ cột Để cho tách tốt α nên có gía trị lớn Hai chất cần tách tách xa khỏi α lớn lớn thời gian phân tích kéo dài, α nên khoảng từ 1,05 đến 2,0 1.2.3.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến lưu giữ Tốc độ di chuyển dải chất tan qua cột hay đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào phân bố phân tử chất tan pha tĩnh pha động Những nhân tố ảnh hưởng đến phân bố hay lưu giữ là: Thành phần tính chất pha động Kiểu tính chất pha tĩnh Các lực tương tác phân tử cấu tử pha động pha tĩnh Nhiệt độ Hai yếu tố góp phần để tách tốt hợp chất sắc kí là: Sự khác thời gian phân bố chúng pha: khác lớn tách chúng tốt Độ dỗng rộng pic rộng tách chúng Sự doãng rộng pic hiệu lực tách 1.3.1 Mở đầu Hiệu lực cột tách chịu tác động độ lớn doãng rộng pic xảy chất chuyển động dọc theo cột Chất tan chạy dọc theo cột có khuynh hướng phân bố hình phân bố chuẩn Gaussian với độ lệch chuẩn σ (hình 5) Nếu chất tan tiêu tốn nhiều thời gian dịch chuyển dọc xuống cột pic bị dỗng rộng Độ doãng rộng pic thường biểu diễn thông qua giá trị:  W1/2 độ rộng của pic đo ½ chiều cao pic,  W độ rộng đáy pic xác định hai điểm cắt hai đường tiếp tuyến hai bên thân pic với đường Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 83 o Biểu đồ gradient biểu diễn phụ thuộc thời gian từ lúc tiêm mẫu với % dung mơi acetonitril sắc đồ (a) hình 3.8 tăng từ 10 dến 90 % 40 phút (với thời gian chờ dung môi gần phút) Pic rửa giải thời điểm phút 14 thành phần dung môi 28% pic rửa giải gần 35.5 phút tương ứng thành phần % dung môi 71% Như biến thiên thành phần dung môi từ 10 đến 28% từ 71 đến 90 % khơng cần thiết o Vì lần chạy sắc kí thứ hai thay đổi thành phần pha động tuyến tính acetonitril từ 28 đến 71% thời gian 40 phút Trong sắc đồ (b) điều kiện chọn khác từ 30 đến 82% 40 phút Kết pic trải rộng thời gian pic tách khỏi cịn 32 phút Trong sắc kí (c), ta muốn xem thử liệu sử dụng khoảng gradient hẹp để giảm thời gian chạy sắc kí Thành phần dung môi pha động lần biến đổi (b) khoảng thời gian 20 phút Kết sắc đồ (c) cho thấy pic khơng phân giải hồn tồn nên sắc kí đồ (b) hợp lí cho phép tách gradient Nếu phép tách sắc kí đồ (b) khơng thể chấp nhận ta thử cải thiện cách giảm tốc độ dòng pha động tiến hành gradient phân đoạn Lí lẽ gradient phân đoạn để sử dụng thành phần dung môi tốt cho vùng sắc kí đồ sau tăng % pha động cho vùng Điều tiến hành dễ dàng Với tất công cụ trên, ta tìm cách cấu tử hỗn hợp khơng chứa q nhiều cấu tử Nếu sắc kí pha đảo thất bại cần chuyển sang phương pháp khác sắc kí pha thuận Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 84 Hình 3.8: Các phép tách gradient tuyến tính mẫu sử dụng cột tách hệ thống dung môi tốc độ dịng 1.0 ml/phut Thời gian chờ dung mơi phút 3.5 Phát triển phép tách Khi phát triển phép tách, chiến lược việc chọn pha động đề cập Tuy nhiên phân tử có phần phân cực phần khơng phân cực mục tiêu hỗ trợ chiến lược phát triển phương pháp khác với thảo luận Để minh họa cho việc tiếp cận phát triển phương pháp cho loại mẫu này, ba loại estrogen mẫu dược phẩm tách Cấu trúc ba loại hình 3.9 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 85 Hình 3.9: Cấu trúc estrogen liên hợp Hình 3.10: Kết tách cuối estrogen (a) Mẫu chuẩn, (b) Mẫu viên thuốc Pha động sử dụng 35/65 MeOH/H2O(v/v) + đệm KH2PO4 0.001M Trong ví dụ tất hợp chất có cấu tạo tương tự mặt cấu trúc, chúng khác mức độ bão hòa vòng thứ hai, điều ngụ ý khác phần không phân cực phân tử Các phân tử muối natri có điện tích -1 hịa tan nước Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 86 Sử dụng cột trao đổi ion có lẽ khơng ý tưởng tốt tất hợp chất có điện tích khơng may pKa chúng khơng biết Bởi có khác biệt cấu trúc phần không phân cực phân tử, ta nên chọn pha tĩnh mà phân biệt đối xử khác phần không phân cực (nếu pKa chúng khác đáng kể tiếp cận phương pháp sắc kí trao đổi ion) Một pha liên kết khơng phân cực C18 lựa chọn thích hợp Trong nhiều trường hợp, việc có sẵn nhiều loại cột không phân cực định loại cột chọn cho phép tách Tuy nhiên, đề cập trước đây, cột C18 cho lưu giữ tốt với khoảng rộng lực rửa giải pha động, cột dùng cho mục đích phổ biến tốt cho pha đảo Sau cột C18 chọn, dung môi mạnh yếu phải chọn Bởi cột khơng phân cực chọn nên nước chọn dung môi yếu cịn metanol dung mơi mạnh Tuy nhiên, acetonitril THF có lẽ chọn dung môi mạnh Lực dung môi theo trật tự sau : metanol < acetonitril < THF Vì thế, chọn metanol trước cho phép uyển chuyển việc chọn hai dung môi sau metalnol không cho kết tách tốt Ngoài metanol xem dung mơi độc so với hai dung mơi Bởi điểm bắt đầu cột pha liên kết C18 10 µm pha động gồm metanol/nước, cần chuẩn bị mẫu chứa chất chuẩn hỗn hợp 50:50 metanol/nước Đây lựa chọn tùy ý thành phần pha động chưa xác định Dung dịch mẫu hòa tan dung môi trường hợp dung dịch chất chuẩn, trộn thời gian ngắn lọc để tách chất khơng hịa tan viên thuốc Bước bắt đầu chạy sắc ký với 100 % metanol pha động với tốc độ pha động thích hợp Metanol kiểm tra dung môi mạnh việc quan sát sau tiêm mẫu, tất hòa tan thể tích chết khơng có tách Như metanol dung môi mạnh làm cho cấu tử cần tách mẫu hòa tan vào pha động không bị lưu giữ pha tĩnh Chất rửa giải phải làm yếu nhờ thêm vào phần trăm biết nước mẫu tiêm vào Qúa trình tiếp tục lưu giữ bắt đầu rõ ràng Trong ví dụ trường hợp 50:50 metanol/nước kết tách tốt 35:65 metanol/nước Bước tiêm chuẩn estrogen xác định lại lưu giữ chúng 3.6 Sắc kí lỏng cột mở 3.6.1 Giới thiệu Trong phương pháp người ta sử dụng cột mở hay cột nhồi với pha động chảy qua Phương pháp phân biệt với phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) chỗ dung môi pha động chảy qua cột trọng lực Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 87 Kĩ thuật sử dụng với tất trình: hấp thụ, phân bố, trao đổi ion, săc kí qua gel Thiết bị thiết lập thực nghiệm trình bày hình 3.11: Hình 3.11: Cấu tạo nguyên tắc hoạt động cột sắc kí cột mở Hiện nhiều ứng dụng phân tích định tính kĩ thuật thay sắc kí mỏng HPLC Sự phổ biến HPLC làm giảm nhiều ứng dụng khác kĩ thuật Tuy nhiên, sử dụng nhiều phép tách với lượng lớn (> 10 g) hỗn hợp phản ứng tổng hợp hữu cơ, công việc cô lập chiết tách hợp chất hữu tự nhiên 3.6.2 Các vấn đề thực nghiệm 3.6.2.1 Cột thủ tục nhồi cột Sắc kí cột mở thực chủ yếu cột thủy tinh Kích thước cột phụ thuộc vào số lượng chất cần tách Cột nhỏ có đường kính vài milimet chiều dài vài cm, cột lớn vài cm đường kính chiều dài tương ứng dài Để thu hiệu lớn cột phải nhồi thích hợp Ảnh hưởng kích thước hạt thủ tục nhồi cột thảo luận chương trước Do phương pháp sử dụng trọng lực dung môi chảy xuyên qua cột nên kích thước hạt nhồi phải > 150 micromet để thu tốc độ dòng chảy chấp nhận Cột phải nhồi đồng để làm giảm thiểu đến mức nhỏ biến dạng sắc kí Một vấn đề cần y bọt khơng khí q trình nhồi cột Để ngăn ảnh hưởng đến mức có thể, chất nhồi cột nên trộn với dung môi với tỉ lệ 1:3 rót thành Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 88 dịng mỏng vào vào cột Nếu kích thước hạt đồng cột dễ để nhồi Khi nhồi cột q trình tách khơng cột khơ vị trí dẫn đến khơng khí xâm nhập vào vị trí 3.6.2.2 Nạp mẫu Mẫu nên đưa vào đầu cột chuẩn bị xong cột pha với lượng dung mơi dùng rửa giải thích hợp Phần cột bảo vệ lớp bơng thủy tinh, giấy lọc… Khi tất mẫu hấp phụ hết rót dung mơi rửa giải vào tiến hành sắc kí Dung mơi nạp liên tục theo yều cầu phép tách 3.6.2.3 Các thủ tục rửa giải Có ba thủ tục rửa giải chính: rửa giải đồng hệ (isocratic), rửa giải phân đoạn fractional (stepwise) rửa giải biến thiên gradient: Isocratic thủ tục rửa giải với hỗn hợp dung mơi có thành phần khơng thay đổi q trình chạy sắc kí hồn thành tách Factional thủ tục rửa giải sử dụng dung môi hỗn hợp dung mơi thích hợp để lập tách một nhóm cấu tử cần tách mẫu Thỉnh thoảng sử dụng nhiều dung mơi khác có lực rửa giải tăng dần để tách cấu tử nhóm cấu tử khác Gradient thủ tục sử dụng môi trường rửa giải thay đổi liên tục, nghĩa nồng độ dung môi hỗn hợp thay đổi biến thiên theo thời gian Ảnh hưởng thủ tục rửa giải chất hấp phụ mạnh dần giảm tượng kéo đuôi Điều có nghĩa dải sắc kí có khuynh hướng đậm dặc cột chiếm cột 3.6.3 Sắc kí hấp phụ 3.6.3.1 Dung mơi Chất rửa giải sử dụng sắc kí hấp phụ dựa dung môi không phân cực hexan chứa lượng nhỏ nhóm phân cực 2-propanol Khi mẫu đưa vào cột phân tử mẫu có chứa nhóm chức phân cực liên kết với vị trí hoạt hóa chất nhồi Chúng bị thay phân tử có chứa nhóm phân cực chất rửa giải khai triển sắc kí di chuyển xuống vị trí phía cột Việc thay dễ hay không phụ thuộc vào độ phân cực tương đối chúng Các phân tử phân cực hấp phụ mạnh di chuyển chậm cột Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 89 Các dung mơi đề cập đóng vai trị cạnh tranh với phân tử mẫu vị trí hoạt động chất hấp phụ Như vậy, phân tử dung môi liên kết mạnh với pha tĩnh chất mẫu nằm pha động lâu chúng rửa giải nhanh Vì lưu giữ khơng bị ảnh hưởng nhiều khả hòa tan mẫu chất rửa giải mà khả hấp phụ dung mơi Dung mơi ban đầu nên chọn có lực rửa giải trung bình để dung mơi mạnh thử Nói chung, với chất hấp phụ phân cực oxit nhôm silicagen, khả hấp phụ tăng lên chất bị hấp phụ có tính phân cực tăng Đối với cacbon trật tự ngược lại Trappe tìm thấy lực rửa giải loạt dung môi cho chất hấp phụ cột chứa silicagen giảm theo trật tự sau: Nước nguyên chất > methanol> etanol > propanol > aceton > etyl axetat > dietyl ête > clorofom > diclometan > benzene > toluene > tricloetylen > cacbon tetraclorua > cyclohexan > hexan Thực tế, dung môi yếu tố kiểm sốt sắc kí hấp phụ Với dãy ta chọn dung mơi hỗn hợp dung mơi với lực rửa giải thích hợp 3.6.3.2 Chất hấp phụ pha tĩnh Trên bề mặt mạng lưới chất hấp phụ xốp Al2O3, silicagen có chứa nhóm phân cực hydroxyl –OH, nhóm tương tác bề mặt với phân tử chất tan (Al2O3 có chi tiết cấu trúc thêm thảo luận phần sau) Nhiều chất rắn sử dụng làm chất hấp phụ liệt kê bảng với hợp chất cần tách chủ yếu chất hữu (các chất vô cần tách cần sử dụng phương pháp sắc kí ion) Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 90 Các chất hấp phụ sử dụng làm pha tĩnh có tính phân cực mạnh Al2O3, silicagen, đá vơi… có khả hấp phụ mạnh hợp chất có nhóm phân cực theo trật tự sau: -CH=CH- < -OCH3 < -COOR < =C=O < -CHO < -SH < -NH2 < -OH < -COOH Trật tự đảo ngược cacbon 3.6.3.3 Chuẩn bị chất hấp phụ Silicagen Silica hay silica gel hay axit silixic tên chung cho vật liệu điều chế cho natri silicat tác dụng với axit sunfuric tạo gel, rửa sấy khô pH cuối dung dịch chứa gel xác định diện tích bề mặt cụ thể Ví dụ, pH 3.72 diện tích bề mặt 830 m2g-1, pH 5.72 348 m2g-1 Khi điều chế nhiều lần cần giữ giá trị pH không đổi nhờ dung dịch đệm axetic axit/axetat natri Các vị trí hoạt động bề mặt gồm nhóm silanol –Si-OH với khoảng cách khoảng 5Ao Các thủ tục để bổ sung tính hoạt động bề mặt phụ thuộc vào việc tách thêm nước Bề mặt hấp phụ nước che vị trí hoạt động tách cách đơn giản gia nhiệt Tuy nhiên đun nóng nhiệt độ cao cở 400oC dẫn đến hồn tồn tính hoạt động bề mặt tách loại phân tử nước từ hai nhóm silanol kề tạo thành mối liên kết ete hai nhóm (khơng có hoạt tính sắc kí) Alumina Bề mặt oxit nhơm có khả thể kiểu tương tác chất tan-chất hấp thụ khác Điều trước hết có trường dương điện mạnh xung quanh Al3+, cho phép tương tác với chất dễ bị phân cực hóa Vì thích hợp silicagen việc phân giải hợp chất thơm từ olefin Thứ hai, vị trí bazơ (có lẽ O2- ) cho phép tương tác với chất nhường proton Sự chuẩn bị hoạt hóa alumina khác với silicagen chỗ hoạt tính tăng lên tăng nhiệt độ hoạt hóa Alumina hoạt tính cao tạo đun nóng nhiệt độ 400oC qua đêm Bề mặt bị hoạt tính nước hydrat trở lại Alumina sử dụng rộng rãi silicagen chúng có khuynh hướng làm xúc tác cho nhiều phản ứng 3.6.4 Sắc kí phân bố Trong sắc kí phân bố chất hấp phụ rắn thay nhồi vào cột chất mang rắn có phủ pha tĩnh lỏng Pha tĩnh lỏng khơng hịa tan khơng trộn lẫn với pha động Sắc kí phân bố kĩ thuật lợi dụng khả chất tan phân bố hai pha Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 91 Cơ sở phương pháp khác hệ số phân bố cấu tử khác nhau, cho pha động thích hợp qua hỗn hợp bị phân giải Chất mang rắn Các chất mang nói chung sử dụng silicagel, diatomit, xenlulo Chất mang sử dụng pha tĩnh chất trơ chất cần tách Chất rắn có phủ pha lỏng nhồi vào cột sắc kí hấp phụ Cột tương tự Chất mang phải hấp phụ lưu giữ pha tĩnh lỏng phải có diện tích bề mặt rộng Nó phải bền dễ dàng nhồi vào cột phủ pha tĩnh lỏng không cản trở dòng chảy pha động Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 92 Khó khăn lớn tránh khỏi công hiệu ứng hấp phụ Thậm chí bề mặt chất mang phủ kín với pha lỏng tĩnh, hiệu ứng hấp phụ cịn Khi phủ kín bề mặt khơng dễ đạt hấp phụ ảnh hưởng tách 3.7 Sắc kí lỏng mặt phẳng Sắc kí giấy sắc kí lớp mỏng xây dựng, phát triển ứng dụng từ lâu Tuy nhiên sắc kí giấy sử dụng Trong sắc kí mặt phẳng, q trình sắc kí tiến hành tờ giấy hay lớp bột rải giữ mặt kính, chất dẻo hay kim loại, ví dụ nhơm Bản thân lớp mỏng pha tĩnh chất mang để giữ pha tĩnh Pha động chất lỏng thấm chạy lớp mỏng tác dụng lực mao dẫn trọng lực điện Phổ biến sắc kí lớp mỏng Ở nước ta phương pháp sắc kí lớp mỏng sử dụng rộng rãi, có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm phương pháp 3.7.1 Vai trò phương pháp SKLM Về mặt lí thuyết chủng loại pha tĩnh động, mặt ứng dụng, SKLM sắc kí lỏng cột giống Vì SKLM dùng để tìm điều kiện tối ưu cho tách săc kí lỏng cột Ưu điểm SKLM tiến hành nhanh chóng tốn thí nghiệm thăm dị cho sắc kí cột SKLM dùng để thử độ tinh khiết sản phẩm dùng nhiều phịng thí nghiệm, nghiên cứu sinh học, hóa sinh… 3.7.2 Nguyên tắc SKLM SKLM thường tiến hành thủy tinh có rải lợp mỏng dính hạt bột mịn Lớp mỏng thường dùng làm pha tĩnh Các pha tĩnh động SKLM tương tự pha sắc kí lỏng hiệu cao (sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố pha thuận pha ngược, sắc kí trao đổi ion, sắc kí gel) Chuẩn bị lớp mỏng Bột dùng để chế tạo lớp mỏng ( ví dụ bột silicagen) thường thêm nước thành bột nhão rải lên bề mặt sach kính hay chất dẻo (hoặc phiến kính dùng để soi kính hiển vi) thành lớp mỏng Người ta thường cho thêm chất kết dính (như bột bó) bột nhão để giữ hạt dính với dính mặt kính Tấm kính để yên cho lớp mỏng định hình dính vào mặt kính sau đem sấy vài tủ sấy Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 93 Một số hãng hóa chất chế tạo sẵn nhiều loại mỏng silicagen thị huỳnh quang tia tử ngoại bước sóng 254 nm Khai triển sắc kí Là q trình cho pha động chạy xuyên qua pha tĩnh kéo mẫu phân tích di chuyển pha tĩnh Thường người ta chấm giọt mẫu phân tích gần mép mỏng Dùng bút chì đánh dấu nơi chấm mẫu Sau giọt mẫu khô, đặt mỏng vào bình sắc kí bão hịa dung mơi pha động, mép phía chấm mẫu nhúng vào dung môi pha động không cho điểm chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động Sau dung môi chạy nửa hay hai phần ba mỏng lấy sấy khơ Có hai cách triển khai: o Sắc kí lên o Sắc kí ngang Trên hình sắc đồ hai chiều số axit amin Mẫu thử chấm góc lớp mỏng (nơi đánh dấu x) cho dung môi A chạy, bay dung môi , quay 90o cho dung môi B chạy, bay dung môi, phun nihidrin thuốc thử màu axit amin Xác định chất cách so sánh vị trí vết mẫu với vết chuẩn Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 94 Hình 33: Khai triển sắc kí theo hai chiều Phát vết mỏng Có nhiều phương pháp để phát vết: Hai cách phổ biến dùng để phát hầu hết chất hữu phun dung dịch iot hay axit sunfuric: xuất vết màu tối Có thể phun thuốc thử đặc hiệu (như ninhydrin) Cũng thêm chất huỳnh quang vào pha tĩnh: mỏng sáng (huỳnh quang) soi đèn tử ngoại (ví dụ đèn có xạ 254 nm) nơi có chất phân tích tối có màu huỳnh quang khác với màu sáng mỏng Có thể tóm tắt phương pháp phát sau:  Nếu hợp chất có màu cần ánh sáng ban ngày  Dùng tia tử ngoại UV cho hợp chất phát huỳnh quang (có hệ nối đơi liên hợp)  Phun iot cho hợp chất chứa nối đơi  Dùng thuốc thử Dragendorff để dị tìm alkalo id  Dùng thuốc thử FeCl3 cho hợp chất họ pheno l  Dùng aniline phtalat để phát loại đường  Dùng Ninhydrin để phát hợp chất nitro amin, amino axit Phân tích bán định lượng Có thể ước lượng (bán định lượng) lượng chất sắc đồ cách so sánh diện tích vết mẫu thử với diện tích vết chuẩn Có thể thu kết tốt cạo lấy bột chứa vết, chiết lấy chất phân tích đem định lượng phương pháp lí hóa thích hợp Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 95 Bài tập Câu 3.1: Trình bày khác sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố, sắc kí trao đổi ion sắc kí rây phân tử Câu 3.2: Giải thích lực rửa giải tăng lên dung môi pha động trở nên phân cực sắc kí pha đảo, lực rửa gải tăng lên dung môi pha động trở nên phân cực sắc kí pha thuận Câu 3.3: Tại áp suất cao cần thiết sắc kí lỏng hiệu cao? Pha liên kết sắc kí lỏng gí? Cho biết số pha lỏng liên kết không phân cực , phân cực trung bình phân cực mạnh Câu 3.4: Trình bày nguyên tắc hoạt động loại detector sử dụng HPLC: a) b) c) d) Detector UV-VIS Detector Photo diodArray Detector đo số khúc xạ Detector phát huỳnh quang Câu 3.5: Cho biết loại cấu tử tách sắc kí lỏng hiệu cao tách sắc kí khí Câu 3.6: Cho biết bước phát triển phép tách isocratic sắc kí pha đảo sử dụng dung môi hữu hai dung mơi hữu Câu 3.7: Dự đốn trật tự rửa giải chất sau: a) n-hexan, n-hexanol, benzene b) ethyl axetate, diethyl ether, nitrobutane Khi thực phép tách sắc kí pha thường sắc kí pha đảo Câu 3.8: Các chất phân cực tách HPLC có cột tách chứa pha tĩnh phân cực polyetylenglycol Hỏi thời gian lưu chúng thay đổi pha động gồm CH3CN/H2O có nồng độ acetonitril thay đổi từ 40 lên 60% Câu 3.9: Khi bạn cố gắng tách hỗn hợp chất chưa biết sắc kí pha đảo với pha động 50% acetonil/50% nước thu sắc kí đồ có pic nằm gần đước rửa giải khoảng k’=2-6 Vậy lần chạy bạn nên tăng hay giảm thành phần acetonitril pha động để cải thiện độ phân giải Giải thích ? Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 96 Câu 3.10: Một hỗn hợp n-heptane, tetrahydrofuran, 2-butanone, n-propanol rửa giải theo thứ tự khỏi cột pha tĩnh phân cực Carbowax Trật tự rủa giải đảo ngược theo thứ tự nàu sử dụng cột pha đảo không phân cực C18 Hãy giải thích trật tự rửa gải trường hợp Câu 3.11: Haddad cộng báo cáo hệ số dung lượng sau phép tách pha đảo salicylamide (k sal) caffeine (k caff) %v/v methanol 30% 35% 40% 45% 50% 55% k’sal 2.4 1.6 1.6 1.0 0.7 0.7 k’caff 4.3 2.8 2.3 1.4 1.1 0.9 Giải thích thay đổi thay đổi giá trị k’ tăng nồng độ methanol pha động Explain the changes in capacity factor Có thuận lợi sử dụng pha động có % methanol thấp ? có bất lợi khơng? Câu 3.12: Giả sử bạn cần tách hỗn hợp benzoic acid, aspartame, caffeine nước giải khát soda Các thông tin thu sau: Hợp chất tr pha động đệm pH 3.0 3.5 4.0 4.5 benzoic acid 7.4 7.0 6.9 4.4 aspartame 5.9 6.0 7.1 8.1 caffeine 3.6 3.7 4.1 4.4 (a) Giải thích thay đổi giá trị thời gian lưu cho hợp chất thay đổi pH pha động (b) Giải thích thời gian lưu hợp chất pha đọng có pH Câu 3.13: 2) Nồng độ PAHs đất xác định cách chiết PAHs methylene chloride Dịch chiết sau pha lỗng, cần thiết, PAHs tách HPLC sử dụng detector UV/Vis detector phát huỳnh quang Trong phép phân tích tiêu biểu, cân 2.013-g mẫu đất khơ chiết 20.00 mL methylene chloride Sau lọc đất, lấy 1-mL phần dịch chiết pha loãng đến 10 mL acetonitrile Tiêm µL dịch chiết pha lỗng vào máy HPLC cho tín hiệu 0.217 (thứ nguyên tùy chọn) cho trường hợp fluoranthene Khi tiêm µL dung dịch chuẩn 20.0-ppm fluoranthene vào máy HPLC điều kiện tín hiệu thu 0.258 Tinhd nồng độ ppm fluoranthene mẫu đất Câu 3.14: Thành phần viên thuốc multivitamin xác định HPLC với diode array UV/Vis detector Tiêm 5- L mẫu chuẩn có chứa 170 ppm vitamin C, 130 ppm niacin, 120 ppm niacinamide, 150 ppm pyridoxine, 60 ppm thiamine, 15 ppm folic acid, and 10 ppm riboflavin vào máy HPLC, cho tín hiệu thoe thứ tự chất (thứ nguyên tùy chọn), 0.22, 1.35, 0.90, 1.37, 0.82, 0.36, 0.29 Viên thuốc chuẩn bị cho phân tích cách ngiền mịn thành bột chuyển vào bình tam giác cở 125-mL chứa 10 mL of 1% v/v NH3 dimethyl sulfoxide Sau siêu âm min, thêm vào 90 mL of 2% acetic acid, hỗn hợ dung dịch khuấy and siêu âm 40 °C Sau dịch đem lọc với giấy lọc cỡ 0.45- m Tiêm 5- L Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký 97 mẫu vừa chuẩn bị máy HPLC điều kiện cho tín hiệu 0.87 cho vitamin C, 0.00 cho niacin, 1.40 cho niacinamide, 0.22 cho pyridoxine, 0.19 cho thiamine, 0.11 cho folic acid, 0.44 cho riboflavin Tính số milligrams chất có viên vitamin Câu 3.15: Lượng caffeine viên thuốc giamr đau xác định HPLC sử dụng phương pháp lập đường chuẩn Các dung dịch chuẩn caffeine chuẩn bị phân tích sử dụng vồng tiêm mẫu tích 10- L Kết đo chuẩn sau Nồng độ chuẩn Tín hiệu (ppm) (thứ nguyên tùy chọn) 50.0 8354 100.0 16925 150.0 25218 200.0 33584 250.0 42002 Mẫu chuẩn bị cách cho viên thuốc cốc nhỏ thêm vào 10 mL methanol Sau mẫu hòa tan chuyển tồn phần dịch phần khơng tan cốc vào bình định mức 25-mL thêm methanol đến vạch Mẫu sau đem lọc, lấy 1.00-mL phần lọc cho vào bình định mức 10-mL thêm methanol đến vạch Khi phân tích HPLC, tín hiệu thu 21469 Tính số milligrams caffeine viên thuốc giảm đau Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký