Xây dưng quy trình phân loại nấm candida

XÂY DƯNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NẤM CANDIDA I Đặt vấn đề Từ thời Hypocrate Galen đề cập y văn giới Frank (1792) mô tả lâm sàng bệnh Wilkinson (1894) nguyên nấm Lodder Kregervan-Rij (1952) phân loại 164 loài nấm men Năm 1984 Kreger-van-Rij 196 loài.Thế giới sử dụng nhiều kỹ thuật định loại nấm men, tính đến phân lập 300 lồi nấm Candida Điều chứng tỏ tỷ lệ nhiễm nấm ngày cao Đặc biệt trước gia tăng bệnh suy giảm miễn dịch, có đại dịch HIV/AIDS nhiều nguyên nhân khác như: thuốc ức chế miễn dịch, dùng corticoid kéo dài, thừa cân béo phì… Hơn nữa, Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới, có nhiệt độ độ ẩm cao điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển, lan truyền dễ dàng gây bệnh người Tại phòng xét nghiệm Nấm Bệnh viện Da liễu TW năm 2010 số lượt bệnh nhân đến xét nghiệm nấm khoảng 25.000.000 lượt, số ca xét nghiệm dương tính 11.900.000 Tỷ lệ nhiễm nấm chủng Candida gây chiếm gần 1/3 Đến năm 2011 số lượng bệnh nhân tăng lên gấp đơi Điều cho thấy xét nghiệm tìm nấm có vai trị quan trọng việc phục vụ bệnh nhân giúp bác sỹ lâm sàng chẩn đoán điều trị hiệu Qua giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội khoa học kỹ thuật, người làm cơng tác xét nghiệm ln có nhiều cải tiến kỹ thuật xét nghiệm cho phù hợp với thời kỳ Năm 1972 Việt Nam áp dụng số kỹ thuật xác định hình thái tính chất hố sinh vi nấm như: • Khả đồng hoá loại đường lên men đường ống pepton lỏng có Brom crezol ống Durham… • Sau đó, năm 1995 xuất test mới: Candiselect-4, Lên men đường test Auxacolor (Bio-rad), API 20… • Gần có máy định danh Vitex • Năm 2010, BV Nhiệt đới Quốc Gia thực hiện: “ Cải tiến quy trình chẩn đốn nấm Candida từ bệnh phẩm tranh mẫu”.( phụ lục) → Nhược điểm: • Nếu định danh máy Vitek → Phụ thuộc vào hoạt động máy định danh đơn vị có máy định danh Nhất tuyến y tế sở • Nhiều máy cài đặt số chủng thường gặp Mà thực tế bệnh nấm chiếm tỷ lệ cao chủng nấm gây bệnh ngày đa dạng phức tạp • Bộ tranh mẫu chẩn đoán sơ 4-5 chủng nấm Candida, mà chủng có ảnh thực tế có 2-3 ảnh nêu khác biệt lồi Candida hình thái vi thể Tuy nhiên, s minh chứng chưa đủ để định loại xác tên lồi Candida gây bệnh • Đặc biệt khó khơng thể định loại trường hợp mẫu bệnh phẩm: + Đồng nhiễm nhiều chủng nấm, + Nghi nhiễm nấm huyết + Mẫu bệnh phẩm khơng vơ khuẩn: Đờm, phân v.v… • Làm cho người thực thụ động lệ thuộc hồn tồn vào hình tranh mẫu Đặc biệt họ lúng túng gặp chủng nấm cần định loại mà khơng có tranh mẫu ( Bộ tranh đinh danh 4-5 lồi Cịn thực tế 300 lồi Candida ) Can • Thao tác phức tạp • Tốn kinh tế Vậy để khắc phục số hạn chế trên, phịng xét nghiệm nấm nói riêng nghi tập thể khoa xét nghiệm nói chung bước xây dựng hệ thống quản lý chất lượng chung phịng thí nghiệm Hệ thống cần thành phần thiết yếu như: quản lý thiết bị, quản lý nhân kiểm sốt q trình thực Mỗi yếu tố bao gồm nhiều khâu, đặc biệt khâu kiểm soát chất lượng xét nghiệm thơng qua xây dựng quy trình thường quy chuẩn Nó coi tài liệu hướng dẫn chi tiết giúp ta bước thực thao tác xét nghiệm (SOPS) Đồng thời, đòi hỏi ngắn gọn, rõ ràng, dễ hiểu phải cập nhật thường xuyên năm lần Từ đó, nhằm đảm bảo xét nghiệm phịng thí nghệm thực đáng tin cậy Để thực tốt cơng việc đó, chúng tơi ln nhận quan tâm đạo tạo nhiều điều kiện thuận lợi Ban Giám Đốc bệnh viện, Ban Lãnh đạo khoa Xét nghiệm Đ ồng th ời, kế thừa kinh nghi ệm c người trước V tiếp thu kiến thức m ới cập nhật t chuyên gia Nấm học CDC Chúng thấy Cải tiến → Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm Candida cần thiết quan trọng Mục đích kỹ thuật: Xây dựng quy trình phân loại nấm men nhằm rút ngắn thời gian, tiết kiệm kinh tế xác Từ đó, giúp cho chẩn đốn điều trị bệnh lý nấm Candida gây cách nhanh v hiệu Đánh giá hiệu hi quy trình có so sánh với số quy trình khác Có thể áp dụng đào tạo chuyển giao kỹ thuật cho tuyến y tế sở Yêu cầu: Quy trình ngắn gọn, dễ hiểu Các thao tác kỹ thuật dễ thực Các môi trường kiểm chuẩn theo hướng dẫn ASM/CDC II Tổng quan Vài nét nấm men ( yeast, levure) Tồn trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn Hình trịn hình bầu dục Kích thước từ – 10 mm, lớn gấp 10 lần vi khuẩn Sinh sản vơ tính theo phương thức nảy chồi Khả thích nghi mơi trường đường cao Tồn thiên nhiên môi trường chứa đường như: hoa quả, rau dưa, mật mía… Tính chất gây bệnh Candida thuộc vi hệ nhiên bền vững thống qua Người ta tìm thấy Candida ký sinh da, họng miệng, đường tiêu hố âm đạo…, mà khơng gây bệnh Chúng gây bệnh có yếu tố thuận lợi, đặc biệt thể suy giảm miễn dịch Những lồi Candida khác có độc tính khác nên khả gây bệnh khác (Hay gặp C.albicans) Candida gây bệnh nhiều quan: Ở nông da, niêm mạc miệng lưỡi, niêm mạc sinh dục nam, nữ xâm nhập sâu gây bệnh: Phổi, tim, nhiễm nấm Candida huyết bệnh cảnh lâm sàng diễn biến nặng nề, nguy kịch, tử vong nhanh… Ngồi ra, cịn gặp số nấm men khác: Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum, Rhodotorula, Protheca… III Đối Đ tượng phương pháp nghiên cứu Đối Đ tượng: - Bệnh phẩm lâm sàng có xét nghiệm trực tiếp dương tính nghi nhiễm B nấm Candida spp - Quy trình định loại sớm nấm Candida s - Thời gian: Từ tháng đến tháng 10 năm 2012 Vật liệu - Chủng nấm: Chủng chuẩn quốc tế có mã số (ATCC: 90028, 66032, 66029, 22019, MYA-4560, 6258, 201382, 204092) chủng nấm bệnh nhân chưa định danh lồi gây bệnh - Mơi trường: Sabouraud + chloramphenicol, Bột ngô + Tween 80, CHROMO agar Candida, Auxacolor, Huyết người khoẻ loại trừ HbsAg (-), HIV(-) khơng dùng thuốc kháng nấm trước 05 ngày Phương pháp tiến hành 2.1 Xây dựng quy trình định loại sớm Candida  Có điểm “mấu chốt” quy trình ( Phụ lục): * Chọn thử nghiệm “đầu tiên” có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhằm sàng lọc nhanh Candida albicans → Test mầm giá đậu (Germ tube test): Thời gian cho kết sơ 3h test dương tính gặp 95% C.albicans * Chọn môi trường nuôi cấy vi thể chọn lọc để quan sát hình thái vi thể đặc trưng nấm Candida phải sẵn mua, rẻ tiền, tự pha chế môi trường → Thạch Bột ngô + Tween 80: Hạt ngô coi “Thực phẩm vàng” bởi: Giàu Vitamin tự nhiên nhóm B (B1, B2,B6, Niacin) khoáng chất cần thiết, giàu chất đạm, chất xơ gấp 4-6 lần gạo, mì Thời gian cho kết 02 ngày * Thay đổi cách cấy lam để quan sát rõ ràng nhiều vị trí hình thái Nấm tiết kiệm mơi trường thao tác dễ thực 2.2 Kiểm tra độ chuẩn xác môi trường pha chế thao tác kỹ thuật - Môi trường Bột ngô + Tween 80 CHROM agar Candida: Lấy chủng nấm men chuẩn CDC (ATCC) cấy kiểm tra môi trường sau đổ xong Nếu chủng nấm mọc mang hình thái đặc trưng chủng nấm mẫu → mơi trường pha chế chuẩn - Khi thao tác kỹ thuật phải làm đồng thời lúc với chủng chuẩn (ATCC) mẫu bệnh phẩm cần định loại Qua đó, vừa làm chứng dương để so sánh vừa kiểm tra độ ổn định tính xác thao tác kỹ thuật Tóm tắt sơ đồ tiếp cận quy trình định danh nấm Candida spp Bệnh phẩm Xét nghiệm trực tiếp(+) Sabouraud+Chloramphenicol 24-48h, tº=25-30ºC Khuẩn lạc Test mầm giá (3h, tº=37ºC) (1) Dương tính 95% C albicans Âm tính Non albicans Bột ngơ+Tween 80 (48h, tº=25-30ºC ) (2) Bào tử màng dày+Giả sợi Các hình thái khác (97%) C krusei C albicans C tropicalis C parapsilosis (3) Auxacolor Auxacolor Auxacolor C glabrata… CHROM agar Candida Tóm tắt quy trình xét nghiệm - Xét nghiệm trực tiếp: • Soi tươi, • Nhuộm Gram, • Dầm mực tàu - Ni cấy: • Sabouraud with chloramphenicol • Nhiệt độ 25-30ºC, • Thời gian 24-48h - Phân loại: • Test ống mầm giá đậu • Thử nghiệm tạo bào tử màng dầy ( mơi trường Bột ngơ), • CROMO agar Candida • Auxacolor (Bio-rad) 3.1 Kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm Candida 3.1.1 Dụng cụ, hố chất - Kính hiển vi quang học - Ete, cồn 90°, đèn cồn - Lam kính, kính - Ống tube thuỷ tinh vô khuẩn - Que cấy, tăm vô khuẩn - Bàn phụ khoa - Mỏ vịt (các kích cỡ) - Pank, thấm nước, - Găng tay, trang - Thuốc nhuộm Gram, Nacl 9‰, KOH 20% - Môi trường Sabouraud +Chloramphenicol+ Actidion - Huyết thỏ( người) - Môi truờng lên men hấp thu đường - Môi trường PCB, KIT Auxacolor hãng Bio-rat 3.1.2 Nội dung xét nghiệm 3.1.2.1 Xét nghiệm trực tiếp * Lấy bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm tuỳ thuộc vào vị trí thương tổn Thơng thường bệnh phẩm xét nghiệm tìm nấm Candida là: - Lưỡi miệng: Dùng dao cùn lấy giả mạc trắng, dùng tăm bơng ngốy họng - Da, móng rãnh quanh móng: Dùng dao cùn cạo thương tổn da nhẵn, cắt khối sừng mủn móng cạo rãnh quanh móng - Bệnh phẩm máu: phải tiến hành nuôi cấy - Bệnh phẩm dịch não tuỷ: ly tâm lấy cặn để soi tươi, nhuộm soi, nuôi cấy - Nếu dịch âm đạo viêm âm hộ - âm đạo nghi Candida: Mở mỏ vịt lấy bệnh phẩm đồ sau * Làm tiêu - Bệnh phẩm da, niêm mạc lưỡi miệng móng đem nhỏ KOH 20% soi kính hiển vi quang học - Dịch đồ sau tiến hành nhuộm Gram soi Nacl 9‰ - Dịch não tuỷ: + Lấy cặn để nhuộm Gram soi tươi Nacl 9‰ + Dầm mực tàu, để yên tĩnh 2-3 phút - Đờm: phết tiêu nhuộm Gram * Nhận định kết - Trên tiêu soi tươi: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính 10, 40: + Bào tử nấm men hình trịn bầu dục, kích thước 3-6- 10m Có nhiều tế bào men nẩy chồi, thấy tượng giả sợi nấm - Trên tiêu nhuộm Gram: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100 Tế bào nấm men có chồi khơng, hình trịn bầu dục, thấy sợi nấm giả sợi Bắt màu Gram dương - Trên tiêu mực tầu thấy tế bào men nảy chồi khơng có vỏ dày, chiết quang Hình ảnh sơ định hướng tới Cryptococcus 3.1.2.2 Nuôi cấy, định loại - Môi trường: Sabouraud, Chloramphenicol (gentamycine), Actidion - Bệnh phẩm sau lấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường theo phương pháp ria cấy cấy điểm Bệnh phẩm sau lấy phải cấy - Ria cấy từ 2-3 ống, t°=25- 30°C 37°C, thời gian sau 24- 48h * Đại thể - Khuẩn lạc tròn, màu trắng kem, sền sệt, bề mặt trơn nhẵn, có số chủng thô ráp, sần sùi Khi để già tạo tua sợi đâm sâu xuống môi trường thạch (C.albicans) * Vi thể - Thay đổi tuỳ theo lồi Nói chung, nấm men hình cầu, hình trịn bầu dục Kích thước thay đổi Tất sinh chồi bào tử chồi trịn thon dài Thường xuất sợi giả ngắn dài, đơi uốn cong, chia nhánh Sợi nấm thật thường dài, xuất bào tử màng dầy ( 95% C.albicans) 3.1.2.2.1 Chẩn đoán giống - Dựa vào đại thể (đã nêu trên) 3.1.2.2.2 Chẩn đốn lồi Thử nghiệm tạo ống mầm.( Germ tube test) Đây thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C.albicans Tuy nhiên, mang tính giả định - Chuẩn bị: + Môi trường: Huyết ngựa ( huyết thỏ, người ) + Kỹ thuật: • Lấy pipet hút 200 l huyết cho vào ống tube thuỷ tinh hấp vơ khuẩn • Dùng ăng chữ L lấy lượng khuẩn lạc nhỏ đầu ăng • Hoà tan hoàn toàn vào ống tube nhỏ sẵn huyết • Đem ủ 37°C, thời gian khoảng 3h • Lấy giọt dung dịch nhỏ lên lam kính sạch, đậy kính đem soi kính hiển vi quang học - Nhận định kết quả: Vật kính 10 nhận định sơ bộ, vật kính 40 khẳng định - Tiến hành kiểm định kết hai quy trình: “Bộ tranh mẫu” “Quy trình mới” nhằm định danh Candida spp cách: Thực đồng thời thao tác kỹ thuật áp dụng quy trình chủng nấm mẫu chưa biết trước tên loài nấm, biết mã số( ATCC: 90028, 66032, 22019, 66029, MYA-4560, 6258, 201382, 204092)→ Bảng - Áp dụng “Quy trình mới” định loại mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm nấm Candida Bên cạnh đó, đồng thời áp dụng “quy trình mới” với chủng ATCC nhằm mục đích tạo chứng dương so sánh kiểm tra độ xác thao tác kỹ thuật + Chúng tơi áp dụng quy trình với số mẫu bệnh phẩm lâm sàng Thường gặp số loài Candida sau: C albicans, C glabrata, C tropicalis, C krusei,C parapsilosis, C guilliermondii… Bảng 1: So sánh kết định loại chủng nấm Candida & chủng nấm men khác (ATCC) Mã Kết quy trình Kết “ Bộ tranh mẫu” “quy trình mới” 90028 C.albicans C.albicans 22019 Không chủng số chuẩn Ghi CDC (ATCC) kết luận C parapsilosis vi thể Không 66029 kết luận C tropicalis MYA4560 Khơng có tranh C gattii Khơng có tranh C orientalis Khơng có tranh C glabata Khơng có tranh T mucoides mẫu 66032 mẫu 201382 Sơ hình thái vi thể mẫu 6258 Sơ hình thái mẫu Khơng có tranh 204092 C neoformans mẫu Tính mớí so với kỹ thuật khác 5.1 Bảng 2: So sánh loại sinh phẩm giá thành xét nghiệm kỹ thuật Thử Sinh phẩm giá thành nghiệm Kỹ thuật khác Kỹ thuật MT nôi cấy Sabouraud 10.000đ/ống/ XN 5.000đ/XN (một đĩa chia làm2) MT tạo Candiselect-4: 10.000đ/XN CHROM agar: 3.000đ/XN (chia làm 3) Mầm giá Huyết thỏ: 5.000đ/XN Huyết người: 1.000đ/XN Cấy Bột gạo (RAT/Bio-rad) Bột ngô +Tween 80 (Tự pha chế) lam kính Mua sẵn: 5.000đ/XN Chuyển Máy định danh Vitek màu đậu hoá đường Giá thành: 2.000đ/XN Auxacolor (Bio-rad) Giá thành: 120.000đ/ XN Giá thành: 90.000đ Api.20: 90.000đ Tổng cộng - Sinh phẩm phải mua nên giá Cao ko đặc hiệu - Chọn sinh phẩm có độ nhạy độ đặc cao cho kết điển hình Và tự trường nên tiết kiệm kinh tế - Giá thành: 240.000đ /BN - Giá thành: 100.000đ/BN (BV thu 120.000đ)) (Khoảng 90% XN giá 10.000 120.000đ) 5.2 Bảng So sánh tính hiệu kỹ thuật Đối với Kỹ thuật Các kỹ thuật khác Máy Vitek Bện Trả kết sau h nhân ngày Kin Chi phí cao 120.000đ h tế Bộ tranh mẫu 7-10 ngày Chi phí từ 30-150.000đ Chu - Đơn giản máy - MT phải mua sẵn: giá yên môn cài đặt sẵn cao, HSD ngắn - Khơng có kinh - KTV bị động phụ nghiệm chẩn đốn thuộc tranh mẫu, - Khơng đinh danh chủng nấm khơng có tranh mẫu - Khơng có kinh nghiệm Nhậ - Đơi máy - Chẩn đốn lồi n định định danh dựa tranh Thực tế kết Card 2-3 tranh có ý nghĩa định danh chưa cài đặt khẳng định chủng nấm C.albicans 3-5 ngày Dao 100.000đ động 10-20- - MT tự pha chế & kiểm chuẩn Không phải mua sẵn, nên dễ kiếm, rẻ tiền chủ động pha chế → Thực hiên tuyến sở - Thao tác dễ dàng - Tích luỹ kinh nghiệm - MT Bột ngơ: hình ảnh vi thể đặc trưng loài, dễ nhận định kết - MT CHROM – Candida: - Mất điện, - MT Cand iselect-4: hao mòn máy Khẳng định C.albicans(màu thường xun bảo trì, tím) Cịn lồi khác cho màu xanh nên đốn chừng bảo dưỡng - Khơng thể dựa vào hình thái phân biệt C.albicans C.dubliensis Mà phân biệt chúng PCR - Chưa định danh số loài Candida khác: C krusei, C.glabrata … Hiển thị màu sắc khác đặc trưng loài Rất dễ nhận biết Độ nhạy, độ đặc hiệu 95% - Đặc biệt phát C.krusei báo cáo tình trạng kháng tự nhiên với Fluconazol - Định loại hầu hết loài Candida * Ưu điểm: Quy trình định loại - Thao tác đơn giản, dễ dàng quan sát nấm phát triển - Môi trường tự pha chế, dễ kiếm, cho kết nhanh, số lượng nhiều điển hình (Bột ngơ, CHROM agar Candida ) - Tiết kiệm kinh tế (10.000đ/xét nghiệm, chiếm 90% BN) - Rút ngắn thời gian( Trước 10 ngày, ngày Vì lồng ghép kỹ thuật) - Tích luỹ kinh nghiệm - Định danh hầu hết loài nấm Candida gây bệnh Ngoài ra, định danh số nấm men khác - Nếu làm thêm kỹ thuật Kháng sinh đồ nấm tiến hành lồng ghép quy trình nên bệnh nhân không thêm thời gian chờ đợi kết - Triển khai đào tạo chuyển giao cho tuyến y tế sở Kiến nghị - Triển khai quy trình định loại Candida phòng xét nghiệm nấm BV Da liễu TW - Có thể đào tạo chuyển giao kỹ thuật tuyến y tế sở - Tiến hành đánh giá độ nhạy cảm chủng nấm men với kháng sinh chống nấm Tài liệu tham khảo: GS Nguyễn Thị Đào(2003), Bệnh nấm thường gặp, NXB Từ điển Bách Khoa Prof.Dr Victo Silva.V(2011), Clinical MYCOLOGY Workshop, pp 2-15 Hèlène Koenig (1995), Guide de MYCOLOGY MEDICALE, pp 44-58 Phụ lục KOH 20% Bệnh phẩm Nhuôm Gram Giả sợi tế bào nấm men Ống thạch Sabouraud Cấy bệnh nhân/ống Đĩa thạch Sabouraud Chia đôi đĩa thạch cấy BN Test ống mầm giá đậu: dương tính Đọc 3h, 37ºC Test ống mầm: Âm tính CDC/ ASM Cấy đường 1lam kính phủ đầy thạch Kỹ thuật Cấy đường miếng thạch d=2cm Kỹ thuật cũ Cấy điểm giọt thạch Kỹ thuật cấy lam Mục đích: Quan sát hình thái vi thể đặc trưng cho số loài Candida Kỹ th Cắt khối cấ Kỹ thuật cổ điển Cắt khối thạch vuông cấy điểm Bào tử màng dày+ giả sợi C kru Thử nghiệm sinh hoá Nấm men Sei Kỹ thuật cũ Lên men đường Đồng hoá đường Kỹ thuật 48 Auxacolor 30ºC, 24-48-72h, Định danh 25 loài nấm men API Candida 35ºC, 24-48h Định danh 13 lồi nấm men Mơi trường tạo màu Mục đích: Chẩn đoán phát đồng nhiễm nhiều chủng nấm men - Màu tím: Khẳng định C.albicans - Màu xanh: Đốn chừng loài C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei Candiselect-4, đọc sau 48h, 30ºC , C.parapsilosis parapsilosisis parapsilos is C glabrata ppppppppppp aapaparapsilo sis Geotrichu mmm C.albicans albicans - Xác định loài Candida thể qua màu khác nhau, dễ nhận biết - Ngoài ra, xác định loài nấm men hay gặp: 48 h 37C thạch Chrom Candida Geotricum Trichosporon C.tropicalis tropicalis Trichosporo nnn C.novergenisi sssssss C.krusei - Thạch Chrom Candida - Đọc sau 48h, 37ºC Ref.: FRANK C ODDS* AND RIA BERNAERTS CHROMagar Candida, a New Differential Isolation Medium for Presumptive Identification of Clinically Important Candida Species (Chrom agar homepage) C.parspsilosis C.glabrata C.krusei C.tropicalis C.albicans ... cập nhật t chuyên gia Nấm học CDC Chúng tơi thấy Cải tiến → Xây dựng quy trình phân loại sớm nấm Candida cần thiết quan trọng Mục đích kỹ thuật: Xây dựng quy trình phân loại nấm men nhằm rút ngắn... nấm trước ngày Kết bàn luận - Tiến hành kiểm định kết hai quy trình: “Bộ tranh mẫu” ? ?Quy trình mới” nhằm định danh Candida spp cách: Thực đồng thời thao tác kỹ thuật áp dụng quy trình chủng nấm. .. nghiệm trực tiếp dương tính nghi nhiễm B nấm Candida spp - Quy trình định loại sớm nấm Candida s - Thời gian: Từ tháng đến tháng 10 năm 2012 Vật liệu - Chủng nấm: Chủng chuẩn quốc tế có mã số (ATCC: