TNU Journal of Science and Technology 228(01) 211 218 http //jst tnu edu vn 211 Email jst@tnu edu vn STUYDING ON GENOTYPE AND ALLELE FREQUENCY OF CYP2E1*5B AND CYP2E1*7B POLYMORPHISM AT A VIETNAMESE G[.]
TNU Journal of Science and Technology 228(01): 211 - 218 STUYDING ON GENOTYPE AND ALLELE FREQUENCY OF CYP2E1*5B AND CYP2E1*7B POLYMORPHISM AT A VIETNAMESE GROUP LIVING IN THE NOTHERN PROVINCES Bui Thi Thu Huong1, Nguyen Phuong Thao2, Nguyen Thi Yen2, Hoang Thi Thu Yen2* 1TNU - University of Medicine and Pharmacy, 2TNU - University of Sciences ARTICLE INFO ABSTRACT Cytochrome P450 family subfamily E member (CYP2E1) converts ethanol to Received: 21/7/2022 acetaldehyde and reactive oxygen species that can cause liver damage and develope Revised: 04/11/2022 liver cancer in alcoholics CYP2E1*5B T, CYP2E1*7B T of CYP2E1*5B (C-1053T; rs2031920/rs3813867) and CYP2E1*7B polymorphisms (G-71T; rs6413420) belong to Published: 23/11/2022 the regulation region (5’-flanking region) is thought to enhance in CYP2E1 gene transcription In this study, we determined allele and genotype frequency of KEYWORDS CYP2E1*5B and CYP2E1*7B in 96 Vietnamese individuals for health checking and treatment at Thai Nguyen national hospital by identifying and nucleotide sequence Alcohol abuse analyzing In 96 research individuals, 65 individuals were for the wild homozygous Cytochrome P450 family genotype CYP2E1*5B CC with the highest rate of 67.71%; 29 individuals with subfamily E member (CYP2E1) heterozygous genotype CYP2E1*5B CT ranked second, accounting for 30.21%, mutant homozygous genotype CYP2E1*5B TT has the lowest rate of 2.083% with cases The CYP2E1*5B allele frequency of the mutant variant CYP2E1*5B T in the study population isn’t small CYP2E1*7B (17.2%) While, CYP2E1*7B is not polymorphic, 100% of individuals have wild rs6413420 homozygous genotype CYP2E1*7B GG Thus, ethanol metabolism in this study population was not affected by the CYP2E1*7B polymorphism, while CYP2E1*5B rs2031920 could have differences in the expression of the CYP2E1 gene This study highlights the need to study the relationship of CYP2E1*5B polymorphisms in alcholism Vietnamese living in the northern provinces and suffer from related diseases NGHIÊN CỨU TẦN SỐ KIỂU GEN, TẦN SỐ ALEN ĐA HÌNH CYP2E1*5B VÀ CYP2E1*7B Ở NHÓM NGƯỜI VIỆT NAM SINH SỐNG TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC Bùi Thị Thu Hương1, Nguyễn Phương Thảo2, Nguyễn Thị Yến2 , Hoàng Thị Thu Yến2* 1Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên, 2Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên THÔNG TIN BÀI BÁO TÓM TẮT CYP2E1 (cytochrome P450 family subfamily E member 1) chuyển hóa ethanol thành Ngày nhận bài: 21/7/2022 acetaldehyde loại oxy phản ứng gây nên tổn thương gan nguy Ngày hoàn thiện: 04/11/2022 phát triển ung thư gan người nghiện rượu Alen CYP2E1*5 T CYP2E1*7B T đa hình CYP2E1*5B (C-1053T; rs2031920/ rs3813867) CYP2E1*7B (G-71T; Ngày đăng: 23/11/2022 rs6413420) thuộc vùng điều khiển (5’-flanking region) gen CYP2E1 chứng minh có vai trị tăng cường q trình phiên mã gen CYP2E1 Trong nghiên TỪ KHÓA cứu này, nghiên cứu tần số kiểu gen, tần số alen đa hình CYP2E1*5B CYP2E1*7B 96 cá thể người Việt Nam đến kiểm tra sức khỏe điều trị Bệnh Lạm dụng rượu viện Trung ương Thái Nguyên phương pháp xác định phân tích trình tự CYP2E1 nucleotide Trong 96 cá thể nghiên cứu, đa hình CYP2E1*5B có 65 cá thể có kiểu gen Alen CYP2E1*5B đồng hợp tử kiểu dại CYP2E1*5B CC với tỷ lệ cao 67,71%; 29 cá thể có kiểu gen dị hợp tử đột biến CYP2E1*5B CT đứng thứ 2, chiếm 30,21%; kiểu gen đồng hợp tử CYP2E1*7B đột biến CYP2E1*5B TT có tỷ lệ thấp 2,083% với trường hợp Tần số alen rs6413420 biến thể đột biến CYP2E1*5B T quần thể nghiên cứu không nhỏ, chiếm rs2031920 17,2% Trong khi, CYP2E1*7B không đa hình, 100% cá thể có kiểu gen đồng hợp CYP2E1*7B GG Do đó, chuyển hóa ethanol nhóm cá thể nghiên cứu không bị ảnh hưởng đa hình CYP2E1*7B, CYP2E1*5B có tính đa hình có khác biệt khả biểu gen CYP2E1 Nghiên cứu đặt vấn đề cần nghiên cứu mối liên quan đa hình CYP2E1*5B nhóm cá thể người sinh sống tỉnh phía Bắc nghiện rượu mắc bệnh liên quan DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.6285 * Corresponding author Email: yenhtt@tnus.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 211 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 211 - 218 Mở đầu Ở người, ethanol chuyển hóa theo hai đường: Con đường oxy hóa khơng oxy hóa [1] Sản phẩm trung gian q trình oxy hóa ethanol acetaldehyde (CH3CHO), chất cực độc biết đến chất gây ung thư [2] Chuyển hóa ethanol xảy chủ yếu thơng qua q trình oxy hóa gan nhờ enzyme: alcohol dehydrogenase (ADH), catalase cytochrom P450 (CYP) Trong đó, CYP họ enzyme chứa sắt có liên quan đến q trình oxy hóa ethanol, steroid, axit béo , biểu với nồng độ cao gan CYP có nhiều isoform, 100 gen xác định CYP họ phân họ E lớp (cytochrome P450 family subfamily E member - CYP2E1) loại CYP có hoạt tính cao chuyển hóa ethanol, cảm ứng uống rượu giai đoạn mãn tính cho đóng vai trị quan trọng chuyển hóa ethanol người nghiện rượu Ở nồng độ ethanol thấp, CYP2E1 chuyển hóa khoảng 10% ethanol gan CYP2E1 chuyển hóa ethanol thành acetaldehyde acetate [1] Khi ethanol chuyển hóa CYP2E1, phân tử có khả phản ứng cao chứa gốc oxy hoạt động (reactive oxygen species -ROS) tạo ROS làm hỏng protein DNA tương tác với chất khác để tạo hợp chất gây ung thư, điều gây nên tổn thương gan nguy phát triển ung thư gan người nghiện rượu [2] Có nhiều đa hình CYP2E1 khác xác định, đa hình CYP2E1*5B thuộc vùng điều khiển (5’-flanking region) gen CYP2E1 (*5B: C-1053T; rs2031920/rs3813867), chứng minh ống nghiệm có ảnh hưởng đến phiên mã gen CYP2E1 [3] Sự diện alen đột biến CYP2E1*5B T (*5B T) đa hình *5B cho liên quan đến tỷ lệ chuyển hóa ethanol cao dẫn đến mức acetaldehyde tăng lên sau uống rượu, đặc biệt người nghiện rượu, gây nguy ung thư [4] CYP2E1*7B (*7B: G-71T; rs6413420) thuộc vùng promoter cho liên quan đến biểu gen Biến thể CYP2E1*7B T (*7B T) có hoạt động phiên mã tăng gấp 1,8 lần so với CYP2E1*7B G (*7B G) Do đó, *7B cho ảnh hưởng đến nguy gây ung thư [5] Lưu Bích Ngọc cộng (2018) điều tra vấn 5200 người Việt Nam khắp tỉnh thành nước cho thấy, người Việt Nam uống rượu, bia mức nghiện nghiện nặng tương đối cao, chiếm 8% [6] Đến nay, đặc điểm trình tự nucleotide gen CYP2E1 người Việt Nam hạn chế Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc điểm trình tự nucleotide đa hình *5B *7B gen CYP2E1 nhóm cá thể người Việt Nam sinh sống số tỉnh phía Bắc Nghiên cứu góp phần xác định khả ảnh hưởng đa hình đến trình biểu gen CYP2E1 làm sở để nghiên cứu mối liên quan đến bệnh chẩn đoán rượu Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu Mẫu nghiên cúu người Việt Nam đến kiểm tra sức khỏe điều trị Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên, thông tin đối tượng lấy mẫu bảo mật, mục tiêu nghiên cứu giải thích với đối tượng nghiên cứu trước tiến hành lấy mẫu Đối tượng nhóm nghiên cứu không huyết thống với nhau, sinh từ năm 1991 đến năm 1950 Nghiên cứu thông qua Hội đồng Y đức Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên 2.2 Phương pháp 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số Các mẫu máu tĩnh mạch đối tượng nghiên cứu bảo quản tách DNA genome theo quy trình hướng dẫn thực mơ tả Hoàng Thị Thu Yến cộng (2021) [7] Sau đó, DNA genome định lượng định tính phương pháp đo mật độ quang máy quang phổ điện di gel agarose 0,8% 2.2.2 Thiết kế mồi PCR khuếch đại đoạn DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 http://jst.tnu.edu.vn 212 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 211 - 218 Mồi oligonucleotide dùng cho kỹ thuật PCR khuếch đại hai đoạn DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 mang đa hình *5B *7B thiết kế dựa trình tự gen sở liệu nucleotide NCBI với mã số NG 008383, tổng hợp cung cấp Cơng ty Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam) (Bảng 1) Bảng Danh sách trình tự mồi sử dụng nghiên cứu STT Trình tự nucleotide (5’-3’)* Tên mồi CYP5B_F CYP5B_R CYP7B_F CYP7B_R GTGAGCCAGTCGAGTCTACATTG CATACAGACCCTCTTCCACCTTC GTGGCTGGAGTTCCCCGTTG GGAGACAATCCTGTGGAAACGG Nhiệt độ gắn mồi Gen đích 58oC Kích thước ước tính (bp) 509 CYP2E1 59oC 347 Các thành phần phản ứng PCR bao gồm: 12,5 µL Taq 2X Master Mix (New England BioLabs, Anh); 0,5 µL mồi xi (10 pM); 0,5 µL mồi ngược (10 pM); µL DNA (20 ng 40ng/µL) 10,5 µL H2O khử ion Phản ứng PCR thực với chu trình nhiệt độ: 95oC phút, 32 chu kỳ (95oC 30 giây, 58-59oC 45 giây, 72oC 30 giây), 72oC 10 phút, sau giữ 4oC Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1,2%, nhuộm ethidium bromide quan sát dưới ánh sáng UV 2.2.3 Xác định trình tự đoạn DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 Mồi xuôi, mồi ngược, sản phẩm PCR sau tinh sinh phẩm Bigdye Terminator V3.1 sử dụng để xác định trình tự DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 máy ABI PRISM 3500 Genetics Analyzer (Applied Biosystems, Hoa Kỳ) Phần mềm tin sinh học Blast BioEdit sử dụng để phân tích kết xác định trình tự nucleotide thu 2.2.4 Phân tích xử lý liệu trình tự Trình tự nucleotide mẫu so sánh với trình tự tham chiếu từ sở liệu NCBI mang mã số NG 008383 cách sử dụng phần mềm BioEdit xác định nucleotide vị trí quan tâm Tần số alen tần số kiểu gen thực Microsoft Excel 2010 Định luật cân Hardy Weinberg áp dụng để đánh giá tần số kiểu gen quần thể Phân bố chuẩn dùng để ước lượng khoảng tin cậy cho tỷ lệ alen, kiểu gen, phép xác suất thống kê dùng nghiên cứu tiến hành cách sử dụng hàm CHITES Microsoft Excel 2010 với độ tin cậy 95%, giá trị p nhỏ 0,05 coi khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết thảo luận 3.1 Khuếch đại đoạn DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 nghiên cứu Các đoạn DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 nghiên cứu khuếch đại từ khuôn DNA genome tách chiết từ mẫu máu tĩnh mạch 96 người tình nguyện kỹ thuật PCR Sản phẩm PCR số mẫu đại diện thu được thể hình cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 mang biến thể *5B *7B mẫu có băng DNA đặc hiệu, có kích thước phù hợp với tính tốn lý thuyết (Bảng 1) Tiếp theo, sản phẩm PCR từ mẫu nghiên cứu tinh để xác định trình tự nucleotide http://jst.tnu.edu.vn 213 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 211 - 218 B A Hình Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn DNA vùng điều khiển gen CYP2E1 kỹ thuật PCR M: thang chuẩn DNA 100 bp (Thermo Scientific); Hình 1A: hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA mang đa hình *5B; 1-9: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA mang đa hình *5B từ số mẫu đại diện nghiên cứu Hình 1B: hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA mang đa hình *7B; 1-7: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA mang đa hình *7B từ số mẫu đại diện nghiên cứu 3.2 Đặc điểm tần số kiểu gen, tần số alen đa hình *5B *7B gen CYP2E1 quần thể mẫu nghiên cứu Phân tích đa hình *5B *7B gen CYP2E1 từ 96 mẫu nghiên cứu cho thấy, *5B xuất kiểu gen gồm đồng hợp tử kiểu dại *5B CC; dị hợp tử *5B CT đồng hợp tử đột biến *5B TT, *7B phát kiểu gen *7B GG (hình 2) Đa hình *5B có kiểu gen đồng hợp kiểu dại CC với tần số cao nhất, 67,71% (N=65), kiểu gen dị hợp tử CT chiếm 30,21% (N= 29) kiểu gen đồng hợp đột biến TT có tỷ lệ thấp 2,083% (N=2) Số cá thể mang alen đột biến có tỉ lệ cao, chiếm 29,69%, alen kiểu dại *5B C chiếm 82,8%, alen đột biến *5B T 17,2% Điều đặc biệt 100% cá thể nghiên cứu có kiểu gen *7B GG Kiểm định với định luật cân di truyền cho quần thể mẫu nghiên cứu, kết tần số alen đột biến *5B T alen dại *7B G trì ổn định quần thể tuân theo định luật Hardy Weinberg với p = 0,896 (Bảng 2) A B Hình Kết xác định trình tự đa hình *5B *7B gen CYP2E1 Đa hình rs2031920 (CYP2E1*5B, CC: đồng hợp tử kiểu dại CC, CYP2E1*5B, CT: dị hợp tử (Y – CT), CYP2E1*5B, TT: đồng hợp tử đột biến TT); B Đa hình rs6413420 (CYP2E1*7B, GG: đồng hợp tử kiểu dại); mũi tên vị trí đa hình http://jst.tnu.edu.vn 214 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 228(01): 211 - 218 Bảng Tần số kiểu gen alen đa hình CYP2E1*5B gen CYP2E1 nhóm mẫu nghiên cứu (N=96) Đa hình Nucleotide thay đổi rs2031920 C-1053T rs6413420 Alen thay đổi *5B C→ *5B T *7B G → *7B T G-71T Kiểu gen alen *5B CC *5B CT *5B TT *5B C *5B T *7B GG *7B GT *7B TT *7B G *7B T Tần số (%) 67,71 30,21 2,083 82,8 17,2 100 0 100 p 0,896 3.3 So sánh tần số alen *5B T *7B G của nhóm mẫu nghiên cứu với nhóm quần thể người đã được công bố Tần số alen *5B T *7B G nhóm người Việt Nam nghiên cứu so sánh với quần thể người nước công bố Tiêu chuẩn chọn quần thể so sánh là: số lượng mẫu nghiên cứu nhóm quần thể lớn 30 (N 30), loại trừ số công bố lâu năm mà có tỷ lệ alen khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê với nước có khu vực địa lý Đối với số nước có nhiều nghiên cứu đa hình dân số, chúng tơi chọn cơng trình cơng bố với số lượng mẫu lớn gần để so sánh Kết so sánh alen *5B T *7B G trình bày bảng Bảng So sánh tần số alen *5B T *7B G người Việt Nam nhóm quần thể cơng bố giới Khu vực Alen *5B T Châu Á Châu Âu Châu Mỹ Quần thể Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Han Hui Tibetan Mongolian Uygur Nhật Bản Thái Lan Iran Ả rập xê út Ý Thổ Nhĩ Kỳ Serbia Bashkortostan Nga Tatars Bashkirs Brazil Chi lê Mỹ Gốc Mexico Gốc Phi Gốc Âu http://jst.tnu.edu.vn Tần số alen (%) N Tài liệu tham khảo 17,2 19 96 118 Nghiên cứu [8] 22,1 21,4 5,8*** 22,3 16,1 17,4 15 1,5*** 0,36*** 3,5*** 2,6*** 5*** 122 112 120 112 118 241 231 200 140 245 302 177 8,5 13,4 9,1 6,8*** 15,5 319 279 132 206 148 15,2 7** 1*** 92 114 126 215 [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology Khu vực Châu Phi Châu Úc Alen*7B G Quần thể Mexico Mestizos Huichols Ma rốc Lebanon Thổ dân Úc 228(01): 211 - 218 Tần số alen (%) N Tài liệu tham khảo 16,1 51,1*** 0,8*** 38,8 2*** 239 99 130 85 239 [22] [23] [24] [25] Việt Nam 100 96 Nghiên cứu Iran 71,5*** 200 [12] Thổ Nhĩ Kỳ 93,3** 163 [26] Châu Âu Đức 96,3* 299 [27] Ghi chú: N: số cá thể cơng trình nghiên cứu *5B *7B công bố; *p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001 Châu Á Hầu hết dân tộc, chủng tộc quần thể nước thuộc châu lục giới vị trí nucleotide -1053 (*5B) – 71 (*7B) gen CYP2E1 có tính đa hình, có tỉ lệ khác quần thể cụ thể Sự phổ biến chứng minh *5B T biến thể mới xuất mà tồn di truyền qua nhiều hệ Kết so sánh alen *5B T người Việt Nam nghiên cứu với nhóm quần thể khác bảng cho thấy, *5B T xuất hầu hết quốc gia thuộc châu lục giới Tần số alen *5B T bảng so sánh dao động từ 0,36 – 51,1%, thấp quần thể người Ả rập xê út, cao dân tộc Huichols người Mexico Nhóm quần thể người Việt Nam nghiên cứu có tần số alen *5B T khơng nhỏ (17,2%), đứng thứ 28 nhóm quần thể so sánh Tần số alen *5B T nghiên cứu có tương đồng với người Việt Nam nghiên cứu Nguyễn Thu Hiền cộng (2018) [8], dân tộc Mestizos người Mexico, người Chi Lê, người Mỹ gốc Mexico, người Bashkortostan hầu hết quần thể người châu Á (p>0,05), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với quần thể lại (p