Nghiên cứu khoa học công nghệ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Escherichia coli SINH ĐỘC TỐ SHIGA PHÂN LẬP TẠI MỘT BẾP ĂN TẬP THỂ Ở KHU VỰC HÀ NỘI LÊ THỊ LAN ANH (1), VŨ THỊ THƯƠNG (1), ĐINH THU MINH (2), BÙI THỊ THANH NGA (1), TẠ THỊ LOAN (1), PHẠM THỊ HÀ GIANG (1,3), PHẠM VIỆT HÙNG (1), TRIỆU PHI LONG (4) ĐẶT VẤN ĐỀ Ngộ độc thực phẩm vi sinh vật đặc biệt E coli báo cáo Việt Nam nhiều quốc gia khác tồn cầu Trong đó, E coli sinh độc tố Shiga (STEC) tác nhân gây bệnh đường ruột chủ yếu toàn giới, gây tiêu chảy kèm theo không kèm theo máu hội chứng urê huyết tán (HUS) làm tắc nghẽn hệ thống lọc thận dẫn đến suy thận, chí đe dọa tính mạng [1] Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính STEC thực phẩm gây triệu ca bệnh 100 trường hợp tử vong [2] Tại Việt Nam, thực phẩm, bàn tay người chế biến hay vật dụng chế biến thực phẩm nhiễm E coli báo cáo nhiều tỉnh thành thành phố Pleiku - Gia Lai, thành phố Huế [3, 4] Tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh có E coli báo cáo Việt Nam giới Tại Việt Nam, tình trạng thực phẩm, nước sinh hoạt dụng cụ chế biến nhiễm E coli bếp ăn tập thể hay sở kinh doanh báo cáo [10, 11], nhiên tính kháng kháng sinh chủng E coli phân lập từ mẫu thực phẩm, mẫu môi trường, mẫu dụng cụ chế biến hạn chế Phần lớn khảo sát tính kháng kháng sinh E coli thực chủng phân lập bệnh viện [11-17] Thực phẩm nhiễm E coli không ảnh hưởng đến sức khỏe người mà gây thiệt hại nặng nề cho kinh tế Đặc biệt, lạm dụng kháng sinh chăn nuôi, điều trị dẫn đến tỷ lệ kháng kháng sinh ngày tăng cao, gây áp lực lớn cho ngành y tế Do đó, nghiên cứu khảo sát tình trạng nhiễm E coli đánh giá tính kháng kháng sinh chúng bếp ăn hay sở chế biến thực phẩm đóng vai trị quan trọng kiểm sốt nguy ngộ độc E coli gây hạn chế việc lạm dụng kháng sinh chăn nuôi, điều trị Trong nghiên cứu này, mẫu thực phẩm, mẫu dịch ngoáy trực tràng, mẫu bàn tay mẫu mặt bàn thu thập bếp ăn tập thể thuộc thành phố Hà Nội khảo sát Các chủng vi khuẩn STEC phân lập môi trường chọn lọc CHROMagarTMSTEC môi trường sử dụng hiệu phân lập STEC gồm O157 chủng khơng phải O157 [5] Các chủng STEC dương tính môi trường chọn lọc định danh hệ thống vitek2 compact kết hợp với giải trình tự gen Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, tính kháng kháng sinh chủng E coli phân lập 24 loại kháng sinh phổ biến khảo sát Kết nghiên cứu đóng vai trị quan trọng giám sát tình trạng nhiễm E coli thực phẩm đánh giá mức độ kháng kháng sinh chúng 90 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu - Chủng chuẩn E coli ATCC 25922 - chủng E coli phân lập từ mẫu thực phẩm, mẫu phết mặt bàn mẫu dịch ngoáy trực tràng nhân viên nhà bếp - 24 loại kháng sinh thử nghiệm (bảng 1) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu - Đối với mẫu thực phẩm: Lấy khoảng 50 g mẫu rau/củ, thịt thuỷ hải sản địa điểm nghiên cứu Mẫu đặt túi nilon chun dụng vơ trùng có nẹp kéo bảo quản 4oC đến 10oC hộp vận chuyển mẫu chuyên dụng Mẫu thu thập vận chuyển phịng thí nghiệm 24 tiến hành ni cấy theo quy trình ISO 6579-2014 24 Tên mẫu mã hóa riêng, ghi thời gian lấy mẫu, địa điểm, loại mẫu - Đối với mẫu mặt bàn/bàn tay: Dùng kẹp/panh vô khuẩn nhúng miếng vô trùng vào dung dịch 10% nước đệm pepton BPW lau bề mặt bàn ăn/ bàn tay Đặt miếng vào ống falcon vô trùng bảo quản 4oC đến 10oC hộp vận chuyển mẫu chuyên dụng - Đối với mẫu ngoáy trực tràng: Yêu cầu bệnh nhân nằm nghiêng bên sang trái, đùi gập sát bụng Làm ướt tăm nước muối vô trùng Luồn tăm bơng vừa qua khỏi vịng hậu mơn xoay nhẹ nhàng Rút tăm kiểm tra để bảo đảm đầu tăm bơng có dính phân Cho tăm vào tuýp chứa môi trường vận chuyển Bẻ phần tăm cho vừa với tuýp chứa môi trường vận chuyển, không chạm vào tuýp xốy chặt nút 2.2.2 Phân lập E coli mơi trường chọn lọc - Đối với mẫu thực phẩm, bổ sung 225ml dung dịch BPW, ủ 37oC 1824 Hút 100 µL dung dịch túi ziplock, sử dụng que cấy 10ul, cấy trực tiếp lên đĩa môi trường nuôi cấy chọn lọc MacConkey Nuôi cấy 37oC vòng 18-24 - Đối với mẫu phết mặt bàn, bàn tay dịch ngoáy trực tràng tăng sinh trực tiếp môi trường BPW, ủ 37oC 18-24 nuôi cấy chọn lọc môi trường MacConkey mẫu thực phẩm - Chọn 2-3 khuẩn lạc đặc trưng E coli để sàng lọc môi trường CHROMagar™ STEC Các khuẩn lạc đặc trưng định danh hệ thống định danh tự động Vitek® Compact 2.2.3 Giải trình tự Các mẫu định danh E coli hệ thống Vitek® Compact giữ dung dịch glycerol 15% tiến hành nuôi cấy, tách chiết DNA PCR giải trình tự gen sử dụng cặp mồi: Gyrase BUP1S (5′Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 91 Nghiên cứu khoa học công nghệ GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′) UP2Sr (5′GCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′), sản phẩm PCR dự kiến có kích thước 1,2 kb [6] DNA tách chiết sử dụng kít G-spin Total DNA extraction (Intron, Hàn Quốc) Quy trình thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm phản ứng PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5%, sau tiến hành tinh giải trình tự Phần mềm MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0) phiên sử dụng để so sánh, phân tích tính tương đồng trình tự gen, định danh chủng thu thập 2.2.4 Xác định tính kháng kháng sinh chủng E coli phân lập Quy trình xác định tính kháng kháng sinh chủng E coli thực theo quy trình thao tác chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng Xét nghiệm (CLSI), Mỹ Danh mục kháng sinh thử nghiệm, hàm lượng giới hạn vùng ức chế trình bày bảng Bảng Danh sách kháng sinh thử nghiệm theo CLSI Nhóm TT thuốc A A A A B B 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 B B B B B B B B B B B B B 92 Kháng sinh Hàm lượng Ampicillin 10 μg Cefazolin 30 μg Gentamicin 10 μg Tobramycin 10 μg Amikacin 30 μg Amoxicillin/Acid 20/10 μg Clavulanic Ampicillin/Sulbactam 10/10 μg Piperacillin/Tazobactam 100/10 μg Ticarcillin/ Acid Clavulanic 75/10 μg Cefuroxime 30 μg Cefepime 30 μg Cefoxitin 30 μg Cefotaxim 30 μg Ciprofloxacin μg Levofloxacin μg Ertapenem 10 μg Imipenem 10 μg Meropenem 10 μg Piperacillin 100 μg Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm) S ≥ 17 ≥ 23 ≥ 15 ≥ 15 ≥ 17 I 14-16 20-22 13-14 13-14 15-16 R ≤ 13 ≤ 19 ≤ 12 ≤ 12 ≤ 14 ≥ 18 14-17 ≤ 13 ≥ 15 ≥ 21 ≥ 20 ≥ 16 ≥ 18 ≥ 18 ≥ 26 ≥ 21 ≥ 17 ≥ 23 ≥ 23 ≥ 23 ≥ 18 12-14 18-20 15-19 13-15 15-17 15-17 23-25 16-20 14-16 20-22 20-22 20-22 - ≤ 11 ≤ 17 ≤ 14 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 14 ≤ 22 ≤ 15 ≤ 13 ≤ 19 ≤ 19 ≤ 19 ≤ 17 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học cơng nghệ TT Nhóm thuốc 20 B 21 22 23 24 C C C C Hàm lượng 1,25/ 23,75 μg 30 μg 30 μg 30 μg 30 μg Kháng sinh Trimethoprim/ Sulfamethxazole Aztreonam Ceftazidime Chloramphenicol Tetracyclin Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm) ≥ 16 11-15 ≤ 10 ≥ 21 ≥ 21 ≥ 18 ≥ 15 18-20 18-20 13-17 12-14 ≤ 17 ≤ 17 ≤ 12 ≤ 11 Ghi chú: Nhóm A: Các kháng sinh cần thử nghiệm báo cáo, nhóm B: kháng sinh cần thử nghiệm chọn lọc báo cáo, nhóm C: kháng sinh chọn lọc báo cáo bổ sung S: Nhạy cảm, I: Trung gian, R: Kháng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết 3.1.1 Phân lập, định danh STEC Trong thời gian từ tháng năm 2021 đến tháng năm 2022, thu thập 280 mẫu có 200 mẫu thực phẩm, 60 mẫu dụng cụ chế biến bề mặt bàn chế biến, 10 mẫu bàn tay người chế biến 10 mẫu dịch ngoáy trực tràng nhân viên chế biến bếp ăn tập thể đơn vị thuộc thành phố Hà Nội Các mẫu phân lập môi trường chọn lọc MacConkey CHROMagar™ STEC Các mẫu dương tính mơi trường Mac conkey CHROMagar™ STEC tiến hành định danh hệ thống định danh tự động Vitek® Compact kết hợp PCR giải trình tự gen dựa vào cặp mồi đặc hiệu gen gyrase Kết Vitek giải trình tự gen cho thấy số 280 mẫu gồm thực phẩm, dụng cụ chế biến, bàn tay người chế biến dịch ngoáy trực tràng phát chủng STEC có mẫu phân lập từ dịch ngốy trực tràng nhân viên chế biến bếp ăn, mẫu phân lập từ thực phẩm (gồm đậu phụ chín, cà chua sốt cà pháo muối) mẫu phân lập từ mặt bàn ăn đơn vị (hình 1) Số lượng chủng STEC phân lập theo nhóm mẫu Dịch ngốy trực tràng Thực phẩm Mặt bàn Hình Số lượng chủng STEC phân lập theo nhóm mẫu Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 93 Nghiên cứu khoa học công nghệ 3.1.2 Khảo sát tính kháng kháng sinh chủng STEC phân lập Để đánh giá tình trạng kháng kháng sinh chủng STEC phân lập được, chủng STEC ni cấy đánh giá tính kháng kháng sinh 24 loại kháng sinh theo khuyến cáo Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng Xét nghiệm (CLSI) kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (kỹ thuật Kirby-Bauer) Danh sách loại kháng sinh sử dụng trình bày bảng 1, phương pháp thực theo hướng dẫn Bộ Y tế [7] Kết cho thấy chủng STEC phân lập có chủng nhạy cảm với tất kháng sinh thử nghiệm (mẫu phân lập từ mẫu dịch ngoáy trực tràng) Trong 8/9 chủng kháng đồng thời với chloramphenicol tetracyclin Trong chủng STEC nghiên cứu, 7/9 chủng kháng trimethoprim/sulfamethxazole, 5/9 chủng kháng với ampicillin, gentamycin, piperacillin, 4/9 chủng phân lập kháng với cefuroxime, cefepime, cefotaxime aztreonam 3/9 chủng kháng với cefazolin, tobramycin 2/9 chủng kháng với ceftazidime 1/9 chủng phân lập kháng với amikacin ciprofloxacin (hình bảng 2) Nghiên cứu Chu Thanh Hương cộng sự, 2009 cho thấy 40/86 (46,51%) chủng E coli phân lập từ thịt gà chợ địa bàn thành phố Hà Nội kháng với ampicillin, 35/86 (40,7%) kháng với ciprofloxacin [8] Kết nghiên cứu chủng E coli phân lập bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết bệnh viện đa khoa tỉnh Thái Bình năm 2018-2019 (73,1% chủng E coli kháng với cefazolin 53,7% kháng cefotaxim) [9] Nghiên cứu tính kháng kháng sinh chủng E coli phân lập từ thịt gà lấy chợ địa bàn thành phố Hà Nội năm 2009 cho thấy 46,51% kháng với ampicillin, 40,7% kháng với ciprofloxacin, 54,65% kháng với trimethoprim/sulfamethxazole [8] Kết nghiên cứu Hoàng Quỳnh Hương cộng năm 2021 cho thấy E coli phân lập Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thái Bình năm 2018-2019 đề kháng với nhiều loại kháng sinh amoxicillin/clavulanicacid, ampicillin/ sulbactam với tỷ lệ 46,9% 54,7% co-trimoxazole 71,4% [9] Nghiên cứu cho thấy 9/9 chủng phân lập nhạy cảm với amoxicillin/clavulanic acid, piperacillin/tazobactam, cefoxitin kháng sinh thuộc nhóm carbapenem ertapenem, imipenem meropenem Hiện nay, nhóm kháng sinh carbapenem cịn cho hiệu điều trị bệnh nhân nhiễm E coli Trong số chủng E coli phân lập nghiên cứu 8/9 chủng kháng với tetracycline 7/9 kháng với trimethoprim/sulfamethxazole nghiên cứu Chu Thanh Hương cộng sự, 2009 cho thấy 47/86 (54,65%) chủng E coli phân lập từ thịt gà chợ địa bàn thành phố Hà Nội kháng với trimethoprim/sulfamethxazole [8] 94 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học cơng nghệ Hình Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng STEC phân lập Bảng Tính kháng, nhạy trung gian với kháng sinh chủng STEC phân lập S (Nhạy) n I (Trung gian) n R (Kháng) n Ampicillin Cefazolin Gentamicin Tobramycin Amikacin Amoxicillin/Acid Clavulanic 0 Ampicillin/Sulbactam Piperacillin/Tazobactam 0 Ticarcillin/Clavulanic Cefuroxime Cefepime 4 Cefoxitin 0 Kháng sinh sử dụng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022 95 Nghiên cứu khoa học công nghệ S (Nhạy) n I (Trung gian) n R (Kháng) n Cefotaxime 4 Ciprofloxacin Levofloxacin Ertapenem 0 Imipenem 0 Meropenem 0 Piperacillin Trimethoprim/Sulfamethxazole Aztreonam 4 Ceftazidime Chloramphenicol Tetracyclin Kháng sinh sử dụng Từ bảng cho thấy chủng E coli phân lập có tính kháng với nhiều loại beta-lactam, bao gồm cephalosporin Tuy nhiên công thức phối hợp với chất ức chế betalactamese hai loại giữ tỷ lệ nhạy cảm 9/9 amoxicillin/acid clavulanic, piperacillin/tazobactam Đồng thời cịn có cefoxitin đảm bảo tính nhạy cảm 100% Điều đáng lưu tâm amikacin, thường dùng điều trị nhiễm vi khuẩn gram âm thể nặng, 1/9 chủng nhạy cảm, 7/9 mức trung gian Đây điều đáng báo động với kháng sinh quan trọng lâm sàng Ngoài ra, trimethoprim/sulfamethxazole vốn kháng sinh thường sử dụng điều trị hội chứng lỵ có 7/9 đề kháng Tỷ lệ kháng phản ánh phần việc sử dụng kháng sinh không hợp lý người dân tự mua sử dụng kháng sinh loại không qua định bác sĩ lâm sàng 3.1.3 Khảo sát tính kháng đa kháng sinh chủng STEC phân lập Kết phân tích kháng sinh đồ chủng STEC cho thấy cịn chủng hồn tồn nhạy cảm với kháng sinh thử nghiệm Các chủng lại thuộc nhóm đa kháng (MDR) theo tiêu chí phân loại CDC [18], với mức độ kháng khác Cụ thể, 8/8 chủng kháng với nhóm kháng sinh gồm trimethoprim/sulfamethxazole, choloraphenicol, tetracyclin Trong 5/8 chủng có thêm đề kháng với penicillin, cephalosporin, aminoglycoside Ngoài 1/8 chủng có tính kháng tồn aminoglycoside bao gồm amikacin, kháng với quinolone (ciprofloxacin) Chủng có tính kháng mạnh phân lập từ dịch ngoáy trực tràng người tham gia phục vụ bếp ăn, cảnh báo tình trạng mang vi khuẩn đa kháng quần thể dân cư 96 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 26, 12 - 2022