BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2022.0096 ỨC CHẾ BIỂU HIỆN DTX3L LÀM GIẢM KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH KHỐI U CỦA TẾ BÀO UNG THƯ MELANOMA B16F10 Ở MƠ HÌNH IN VITRO Nguyễn Đình Thắng1,*, Ichiro Yajima2 Tóm tắt Deltex-3-like (DTX3L) enzyme ligase, thuộc họ Deltex (DTX), có liên quan quan đến số bệnh ung thư, đặc biệt lymphoma Trong nghiên cứu trước, phần chứng minh vai trò DTX3L đến khả di tế bào ung thư melanoma Ở nghiên cứu này, tiếp tục đánh giá ảnh hưởng DTX3L khả hình thành khối u dòng tế bào ung thư melanoma B16F10 suy giảm biểu protein DTX3L (được gọi cB16F10) mơ hình in vitro Kết nghiên cứu cho thấy tế bào cB16F10 có thay đổi hình thái tế bào, quan trọng có giảm mạnh khả hình thành khối u (khối 3-D) thí nghiệm in vitro so với tế bào đối chứng B16F10 Cụ thể, lực hình thành khối 3-D cB16F10 1/8 lần so với dòng tế bào B16F10 Kết nghiên cứu khẳng định vai trị protein DTX3L hình thành phát triển ung thư melanoma, cho thấy tiềm sử dụng DTX3L đích tác dụng điều trị melanoma Từ khóa: Deltex-3-like, melanoma, sinh khối u ĐẶT VẤN ĐỀ Melanoma loại ung thư có đặc tính di cao nguyên nhân gây tử vong cho trường hợp bệnh nhân ung thư da (Miller cs., 2006) Deltex-3-like (DTX3L) ubiquitin E3 ligase có người DTX3L có khả gắn kết với phân tử BAL1 (B Aggressive Lymphoma L) tham gia vào phát sinh tiến triển ung thư lymphoma tế bào B (Aguiar cs., 2000; Takeyama cs., 2003) Mức độ biểu cao gen DTX3L tìm thấy nhiều mơ khác chuột, cao tuyến ức (Hakme cs., 2008) Các kết nghiên cứu cho thấy enzyme DTX3L có hoạt tính monoubiquitin hóa phân tử Histone H4 thơng qua tham gia điều hịa có chọn lọc đáp ứng với hư hỏng DNA Vì vậy, tăng mức độ biểu DTX3L ung thư lymphoma nguyên nhân gây kháng thuốc/tác nhân hóa trị liệu hướng mục tiêu diệt tế bào ung thư thông qua phá hủy DNA (Yan cs., 2009; Yan cs., 2013) DTX3L hình thành phức hợp với ARTD8 ARTD9 tham gia điều hòa biểu phân tử ức chế khối u IRF-1 tế bào ung thư tuyến tiền liệt mPCa (Bachmann cs., 2014) Ngoài ra, nghiên cứu trước đây, thấy ức chế biểu DTX3L dòng tế bào ung thư melanoma B16F10 làm giảm khả di tế bào hai mơ hình in vitro in vivo (Thang cs., 2015) Tuy nhiên, chưa có đánh giá vai trò DTX3L phát triển khối u nói chung ung thư da nói riêng Vì vậy, nghiên cứu này, hướng đến việc đánh giá tác động ức chế biểu DTX3L lên khả hình Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Học viện Kỹ thuật Shibaura, Nhật Bản * Email: ndthang@hus.edu.vn PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 857 thành khối u tế bào B16F10 thông qua kĩ thuật làm tắt biểu gen DTX3L shRNA VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Các dòng tế bào chuột Tế bào B16F10 chuột nude (sạch miễn dịch) cung cấp từ Trung tâm Tài nguyên sinh học Riken (Riken Bio Resource Center) Tế bào B16F10 ni mơi trường RPMI-1640 có bổ sung 10 % huyết thai bò (FBS) % penicillin/streptomycin tủ ổn nhiệt 37 oC cung cấp khí chứa % CO2 2.2 Tạo dòng tế bào suy giảm biểu DTX3L Silencing vector pRNAT-U6-1-Neo (Invitrogen) sử dụng để tạo DTX3Lsilencing vector, có mang gen mã hóa protein phát tín hiệu huỳnh quang (GFP) Đoạn DNA mạch đơi chứa trình tự knockdown gen DTX3L chèn vào vùng BamHI HindIII Vector đối chứng DTX3L-silencing vector chuyển nạp vào tế bào B16F10 Trình tự oligonucleotide đoạn DNA: 5’GATCCGCATGGAGGGTAGTGATGGAATTAATTCAAGAGATTAATTCCATCACT ACCCTCCATGCTTTTTTA -3’; 5’AGCTTAAAAAAGCATGGAGGGTAGTGATGGAATTAATCTCTTGAATTAATTCC ATCACTACCCTCCATGCG -3’ Các dòng tế bào với gen DTX3L bị làm câm chọn lọc cách ni mơi trường có bổ sung mg/ml neomycin (Wako) 2.3 Phân tích biểu protein Tế bào phá vỡ sóng siêu âm, tiến hành ly tâm tốc độ 1500 vòng/phút phút Dịch chứa protein tổng số thu nhận Protein đích thử nghiệm tách tinh sắc kí cột với chất sắc kí phát triển từ vật liệu sinh học melanin Phịng thí nghiệm Hóa sinh Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Mức độ biểu protein DTX3L Tubulin (House-keeping gene) phân tích kỹ thuật Western Blot Phương pháp Western Blot mô tả nghiên cứu trước (Bachmann cs., 2014) Kháng thể đa dòng thỏ kháng DTX3L (Santa Cruz), kháng thể đơn dòng chuột kháng alphaTUBULIN (SIGMA) sử dụng làm kháng thể sơ cấp Kháng thể IgG thỏ IgG chuột sử dụng làm kháng thể thứ cấp 2.4 Phương pháp tạo khối u in vitro Phương pháp tạo khối u in vitro mô tả nghiên cứu trước (Mehruba cs., 2020) Dung dịch gốc polyHEMA 10X chuẩn bị cách hòa tan 2,4 gram polyHEMA 20 mL ethanol (95 %) Dung dịch polyHEMA 1.2 % (dung dịch làm việc) pha loãng từ dung dịch gốc 10X theo tỉ lệ 1:10 ethanol (95 %) lọc qua màng lọc 0.2uM Đĩa 24 giếng tráng lớp 200 µL dung dịch polyHEMA 1.2 % để tủ vô trùng qua đêm cho ethanol bay hồn tồn Hai mươi nghìn tế bào (20.000) mL mơi trường RPMI-1640 có bổ sung 10 % huyết thai bò (FBS) % penicillin/streptomycin tra vào đĩa 24 giếng với bề mặt 858 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM đĩa phủ polyHEMA, ni tủ ổn nhiệt 37 oC có cấp khí CO2 % Sau 72 giờ, colony hình thành có kích thước > 50 µm đếm kính hiển vi 2.5 Phương pháp phân tích thống kê Phân tích thống kê nghiên cứu thực huện theo phương pháp mô tả trước (Kato cs., 2011) Kết lặp lại từ thí nghiệm độc lập nhóm phân tích thống kê khác biệt có hay khơng có ý nghĩa thống kê kiểm định Student’s (Student’s t-test) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hình thái tế bào suy giảm biểu protein DTX3L Sau thời gian khoảng tháng nuôi cấy chọn lọc mơi trường có bổ sung neomycin, dịng tế bào cB16F10 thu nhận Hình thái tế bào quan sát chụp ảnh kính hiển vị huỳnh quang, với tín hiệu huỳnh quang phát GFP Kết thu nhận từ hình ảnh cho thấy tế bào cB16F10 có hình khác biệt so với tế bào B16F10 đối chứng Cụ thể tế bào cB16F10 trở nên đồng phân bố bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 1A), tế bào B16F10 đối chứng có hình thái đa dạng cấu trúc đồng nhất, với phát triển chồng lấn lên phân chia bất thường (Hình 1B) Sự phân chia bất thường đa hình hình thái tế bào đặc tính dòng tế bào ung thư (Kato cs., 2011; Thang cs., 2015) Điều gợi ý rằng, ức chế biểu DTX3L làm giảm đặc tính hình thái tế bào ung thư Hình Hình thái tế bào cB16F10 (A) B16F10 đối chứng (B) chụp kính hiển vi huỳnh quang với độ phóng đại 4X Để đánh giá mức độ biểu protein DTX3L dòng tế bào cB16F10 B16F10 đối chứng, kỹ thuật Western thực hiện, với protein Tubulin sử dụng làm nội chứng Kết phân tích cho thấy mức độ biểu protein DTX3L suy giảm mạnh tế bào cB16F10 so với tế bào B16F10 đối chứng (Hình 2A), mức độ biểu protein nội chứng Tubulin khơng có khác biệt hai dịng tế bào (Hình aB) Điều xác nhận cho thành công việc làm câm gen DTX3L dòng tế bào cB16F10 dẫn tới giảm mạnh sản phẩm dịch mã Kết PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 859 cho thấy mối liên quan mức độ biểu protein DTX3L hình thái tế bào B16F10 Hình Mức độ biểu protein DTX3L (A) Tubulin (B) tế bào B16F10 đối chứng (Ctrl) tế bào suy giảm DTX3L (Sh-C) 3.2 Sự hình thành khối 3-D mơ hình in vitro Hình Sự hình thành colony (khối u in vitro) từ tế bào B16F10 đối chứng (A B) cB16F10 suy giảm biểu DTX3L (A D) Số lượng colony có kích thước > 50 µm hình thành từ tế bào B16F10 đối chứng (NC) cB16F10 suy giảm biểu DTX3L (shRNA) trình bày hình (D) ***: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị P < 0.001 Cùng với khả di khả tăng sinh vơ hạn khả phát triển thành khối u đặc tính đặc biệt quan trọng tế bào ung thư (Thang cs., 2015; Flaherty cs., 2010); McCubrey cs., 2011) Sự hình thành khối u điều hịa nhiều đường tín hiệu với tham gia nhiều phân tử protein/enzyme khác chẳng hạn FAK/PI3K/AKT, Ras/RAF/MEK/ERK hay PTEN/mTOR (Thang cs., 2015; Flaherty cs., 2010; McCubrey cs., 2011) Để tìm hiểu mối liên quan mức độ biểu DTX3L tới khả hình thành khối u mơ hình in vitro (khối 3-D), phương pháp nuôi cấy đĩa phủ polyHEMA thực Kết thí nghiệm 860 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM cho thấy tế bào B16F10 đối chứng có khả hình thành phát triển thành khối 3-D cách dễ dàng (Hình 3A-B), tế bào cB16F10 bị suy giảm mạnh khả hình thành khối 3-D (Hình 3C-D) Cụ thể số lượng khối 3-D có kích thước >50 µm trường hợp cB16F10 1/8 so với trường hợp B16F10 đối chứng (Hình 3D) Kết cho thấy có suy giảm mức độ biểu DTX3L làm giảm khả hình thành khối u in vitro Nghiên cứu trước ức chế biểu DTX3L làm giảm khả di tế bào B16F10 hình in vivo chuột thí nghiệm (Thang cs., 2015), nghiên cứu xác nhận lại kết mô hình in vitro với tế bào ni cấy KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy ức chế biểu protein DTX3L gây thay đổi hình thái tế bào ung thư melanoma B16F10 làm chậm phát triển thành khối u dòng tế bào ung thư Melanoma loại ung thư ác tính gây 80 % ca tử vong bệnh nhân ung thư da Vì vậy, DTX3L nên nghiên cứu sâu để xem xét khả sử dụng đích tác dụng điều trị ung thư da dạng melanoma Lời cảm ơn: Một phần kinh phí nghiên cứu tài trợ Quỹ nghiên cứu châu Á (ARC), khuôn khổ đề tài mang mã số CA 21.06A TÀI LIỆU THAM KHẢO Aguiar, RC., Yakushijin, Y., Kharbanda, S., Salgia, R., Fletcher, JA., Shipp, MA., 2000 BAL is a novel risk-related gene in diffuse large B-cell lymphomas that enhances cellular migration Blood, 96: 4328-4334 Bachmann, SB,, Frommel, SC., Camicia, R., Winkler, HC., Santoro, R., Hassa, PO., 2014 DTX3L and ARTD9 inhibit IRF1 expression and mediate in cooperation with ARTD8 survival and proliferation of metastatic prostate cancer cells Mol Cancer, 13: 125 Flaherty, KT., Puzanov, I., Kim, KB., Ribas, A., McArthur, GA., Sosman, JA., et al., 2010 Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma N Engl J Med, 363: 809-819 Hakme, A., Huber, A., Dolle, A., and Schreiber, V., 2008 The macroPARP Genes Parp-9 and Parp-14 Are Developmentally and Differentially Regulated in Mouse Tissues Developmental dynamics., 237: 209-215 Kato, M., Kumasaka, YM., Takeda, K., Hossain, K., Iida, M., Yajima, I., et al., 2011 Lcysteine as a regulator for arsenic-mediated cancer-promoting and anti-cancer effects Toxicol In Vitro, 25: 623-629 McCubrey, JA., Steelman, LS., Kempf, CR., Chappell, WH., Abrams, SL., Stivala, F., et al., 2011 Therapeutic resistance resulting from mutations in Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR signaling pathways J Cell Physiol, 226: 2762-2781 Miller, A J and Mihm, M C 2006 Melanoma N Engl J Med., 355: 51-65 PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 861 Nazemroaya F., Soheili ZS., Samiei S., Deezagi A., Ahmadieh H., Davari M., et al., 2017 Induced Retro-Differentiation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells on PolyHEMA J Cell Biochem., 118(10): 3080-3089 Takeyama, K., Aguiar, RCT., Gu, L., He, C., Freeman, GJ., Kutok, JL., et al., 2003 The BAL-binding protein, BBAP, and related Deltex family members exhibit E3 ubiquitin ligase activity J Biol Chem, 278: 21930-21937 Thang, ND., Yajima, I., Kumasaka, MY., Iida, M., Suzuki, T., Kato, M., 2015 Deltex-3like (DTX3L) stimulates metastasis of melanoma through FAK/PI3K/AKT but not MEK/ERK pathway Oncotarget, 6(16): 14290-14229 Yan, Q., Dutt, S., Xu, R., Graves, K., Juszczynski, P., Manis, JP., et al., 2009 BBAP Monoubiquitylates Histone H4 at Lysine 91 and Selectively Modulates the DNA Damage Response Molecular Cell, 36: 110-120 Yan, Q., Xu, R., Zhu, L., Cheng, X., Wang, Z., Manis, J., et al., 2013 BAL1 and its partner E3 ligase, BBAP, link Poly(ADP-ribose) activation, ubiquitylation, and double-strand DNA repair independent of ATM, MDC1, and RNF8 Mol Cell Biol, 33: 845-857 SILENCING OF DTX3L DECREASES TUMOR FORMATION ABILITY OF B16F10 MELANOMA CELLS IN VITRO Nguyen Dinh Thang1,*, Ichiro Yajima2 Abstract Deltex-3-like (DTX3L), a ligase belonging to Deltex family, relates to several caners, especially lymphoma In previous study, we had proved that DTX3L might play important role in invasion ability of melanoma cells In this study, we continuously aimed at investigating the relation between downregulation of DTX3L and tumor formation in Dtx3l-deleted B16F10 (named cB16F10) melanoma cells The obtained results showed that the Dtx3l-silenced B16F10 cells had different morphology from control B16F10 and importantly they exhibited very low ability in tumor formation in vitro Particularly, the tumor forming ability of the cB16F10 cells were only 1/8 of that of the control B16F10 cells These results indicated the significant roles of Dtx3l/DTX3L in tumor formation of melanoma cells and it suggests that Dtx3l/DTX3L could be used as a target for melanoma treatment Keywords: Deltex-3-like, melanoma, tumor formation University of Science, Vietnam National University, Hanoi Shibaura Institute of Technology, Japan * Email: ndthang@hus.edu.vn ... novel risk-related gene in diffuse large B-cell lymphomas that enhances cellular migration Blood, 96: 4328-4334 Bachmann, SB,, Frommel, SC., Camicia, R., Winkler, HC., Santoro, R., Hassa, PO., 2014