BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2022.0085 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU BIOCELLULOSE TỰ HỦY SINH HỌC TỪ Acetobacter xylinum ỨNG DỤNG BỌC VÀ BẢO QUẢN THỰC PHẨM Phạm Thị Lan Hương1, Cao Bá Cường2, Nguyễn Xuân Thành2,* Tóm tắt: Các vật liệu sử dụng cho đóng gói thực phẩm thường sản xuất từ nhiên liệu hóa thạch, khơng thể tái tạo khơng thể phân hủy sinh học, vấn đề nghiêm trọng cho môi trường Trong nghiên cứu này, vật liệu tự hủy sinh học cellulose vi khuẩn (CVK) chế tạo thành công từ Acetobacter xylinum môi trường chuẩn (MTC) mơi trường nước vo gạo (MTG), có tính chất phù hợp để bọc bảo quản thực phẩm Kết ảnh chụp SEM cho thấy vật liệu CVK gồm sợi cellulose có kích thước nano tạo mạng lưới cấu trúc không gian ba chiều với sợi đan xen nhau, sợi bề mặt màng có đồng Độ bền kéo đứt độ giãn dài vật liệu CVK-MTC lớn vật liệu CVK-MTG Vật liệu CVK có khả tự hủy sinh học khả cản khuẩn tốt, có tiềm ứng dụng bao bọc bảo quản thực phẩm Từ khóa: Acetobacter xylinum, bọc bảo quản thực phẩm, cellulose vi khuẩn, vật liệu tự hủy sinh học ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng màng ăn (edible films) để kiểm soát vận chuyển nước giúp cải thiện chất lượng thực phẩm kéo dài thời gian bảo quản nhận quan tâm ngày tăng nhà nghiên cứu ngành công nghiệp Mục đích tạo nguyên liệu bọc polyme tự hủy sinh học với đặc tính đặc hiệu, ăn với thực phẩm Màng ăn có tiềm kiểm sốt vận chuyển khối lượng thực phẩm môi trường thành phần khác thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản giúp cải thiện chất lượng tăng thời gian sử dụng thực phẩm Chúng thường làm từ polysaccharid, protein lipid dùng đơn kết hợp theo nghiên cứu Azeredo cộng (2017), Nguyễn Thúy Hương Trần Thị Tưởng An (2008), Padrao cộng (2016), Nguyễn Xuân Thành cộng (2019), Vilela cộng (2019) Gần đây, có nhiều cơng trình nghiên cứu, tìm kiếm loại chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học vật liệu thay polyme dầu mỏ, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Sử dụng chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học bảo quản, chế biến thực phẩm quan tâm nhiều Padrao cộng (2016), Nguyễn Xuân Thành cộng (2019) Trong số polyme phân hủy sinh học, cellulose vi khuẩn (CVK) vật liệu tổng hợp từ vi khuẩn, loại polyme sản xuất từ trình lên men vi sinh vật (VSV) đề cập đến nghiên cứu Azeredo cộng (2017), Nguyễn Thúy Hương Trần Thị Tưởng An (2008), Padrao cộng (2016), Vilela cộng (2019) Vì thế, CVK xem lựa chọn hàng đầu số Trường THPT Kim Anh, Hà Nội Trường Đại học Sư phạm Hà Nội * Email: nguyenxuanthanh@hpu2.edu.vn PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 767 polyme sinh học có khả thay polyme từ dầu mỏ việc bao bọc thực phẩm CVK sản xuất từ nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác theo mô tả Islam cộng (2017), Nguyễn Xuân Thành cộng (2019), có khả giữ thấm hút nước cao, có tính xốp chọn lọc, có cấu trúc mạng sợi siêu mịn cỡ nanomet độ tinh khiết cao CVK làm chất mang giúp cố định Lactococcus lactic thu nhận Bacteriocin để ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu theo nghiên cứu Nguyễn Thúy Hương Trần Thị Tưởng An (2008) CVK cịn có khả hấp phụ số chất lactoferrin tạo loại bao bì kháng khuẩn ăn theo nghiên cứu Padrao cộng (2016) Mục đích nghiên cứu nhằm chế tạo vật liệu tự hủy sinh học cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn nước vo gạo để ứng dụng màng ăn giúp bọc bảo quản thực phẩm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu trang thiết bị nghiên cứu Chủng vi sinh vật: Vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ dịch chè xanh lên men ni cấy Phịng Vi sinh - Động vật, Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Các loài vi khuẩn Staphylococcus haemolyticus, Escherichia coli, nấm mốc chế phẩm vi sinh Sagi Bio cung cấp Viện Công nghệ Môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Hóa chất: Cao nấm men (Mỹ); pepton (European Union); hóa chất khác (diamoni photphat, acid citric, amoni sulfat, ) đạt tiêu chuẩn dùng phân tích Trang thiết bị: Kính hiển vi điện tử quét SEM (6510 LV JOEL, Nhật Bản); Thiết bị đo lý vạn (ZWICK, Đức); Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA, Đức); Nồi hấp khử trùng (HV-110/HIRAIAMA, Nhật Bản); Buồng cấy vơ trùng (Haraeus, Đức); Cân phân tích (Sartorius, Thụy Sỹ); Tủ sấy, tủ ấm (Binder, Đức) Môi trường nuôi cấy theo nghiên cứu Hestrin & Schramm (1954), Islam cộng (2017), Nguyễn Xuân Thành cộng (2019): Môi trường chuẩn (MTC) gồm chất nước cất với % khối lượng glucose (2 %), pepton (0,5 %), diamoni photphat (0,27 %), cao nấm men (0,5 %), acid citric (0,115 %); Môi trường nước vo gạo (MTG) gồm nước gạo chứa glucose (2 %), pepton (1 %), diamoni photphat (0,05 %), amoni sulfat (0,05 %) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Chế tạo vật liệu CVK Lên men thu CVK từ môi trường nuôi cấy (MTC, MTG) gồm bước theo Nguyễn Xuân Thành cộng (2019): Chuẩn bị môi trường; Hấp khử trùng môi trường 121 oC 15 phút; Lấy môi trường khử trùng tia UV 15 phút để nguội; Bổ sung 10 % thể tích dịch giống A xylinum lắc cho giống phân bố dung dịch; Chuyển dịch sang dụng cụ ni cấy theo kích thước nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh 5-7 ngày 28 oC; Thu vật liệu CVK thô độ dày 0,3 cm tạo từ môi trường nuôi cấy (CVK-MTC, CVK-MTG) xử lý tinh để dùng 768 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM nghiên cứu Vật liệu xử lý tinh cách hấp màng dung dịch NaOH %, nhiệt độ 121 oC thời gian 15 phút nồi hấp khử trùng, sau vớt màng ngâm màng vịi nước chảy khoảng đến màng trắng Đánh giá đặc tính vật liệu Cấu trúc vật liệu CVK: Cấu trúc bề mặt vật liệu xác định kính hiển vi điện tử quét SEM theo nghiên cứu Nguyễn Xuân Thành cộng (2019), Vilela cộng (2019): Mẫu sấy 40 oC thời gian 20 phút, sau phủ lớp platin mỏng đặt vào buồng soi mẫu thiết bị Sử dụng kính hiển vi điện tử SEM (6510 LV JOEL, Nhật Bản) Độ bền học vật liệu CVK: Độ bền kéo đứt độ giãn dài màng đánh giá theo phương pháp ASTM D882 theo mô tả Padrao cộng (2016), Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 1862-2 (2010), Nguyễn Xuân Thành cộng (2019) sử dụng thiết bị đo lý vạn (ZWICK, Đức) Độ bền kéo đứt đặc tính chịu lực kéo đứt vật liệu (Lực cực đại đơn vị diện tích mặt cắt ngang ban đầu chiều dài đo); gọi ứng suất kéo cực đại; biểu thị megapascals (MPa) Độ giãn dài biến dạng dài (sự tăng chiều dài) mẫu thử; tính % chiều dài mẫu thử ban đầu (đơn vị mm) Khả cản khuẩn vật liệu CVK: Thử khả cản khuẩn màng CVK phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch đĩa theo mô tả Nguyễn Thúy Hương Trần Thị Tưởng An (2008), Nguyễn Xuân Thành (2019) Sử dụng công thức tạo môi trường thạch tiêu chuẩn gồm glucose %, MgSO4.7H2O 0,5 %, pepton 1,25 %, (NH4)2SO4 0,75 %, thạch Agar %, KH2PO4 0,5 % 250 ml nước cất lần đun sôi Dùng máy rung siêu âm rung phút cho thành phần dinh dưỡng tan đun sôi Chia thạch dinh dưỡng vào đĩa petri với độ dày thạch 0,5 cm Chọn màng CVK chứa 50 % hàm lượng nước, 1: CKV-MTC, 2: CVK-MTG, 3: gạc vô khuẩn Bào tử nấm, vi khuẩn Staphylococcus haemolyticus, Escherichia coli trang lên thạch Đậy nắp đĩa petri để khơng khí thống mát Sau quan sát vi sinh vật phát triển sau ngày, ngày Khả phân hủy sinh học vật liệu CVK: Phân hủy sinh học vật liệu CVK phụ thuộc vào thành phần vật liệu CVK có chất cellulose, polisaccarit có cấu trúc dạng sợi không phân nhành, không xoắn, hợp thành từ mắt xích β-1,4-glicozit CVK cellulose sinh học tổng hợp không chứa ligin hay hemicellulose Vì vậy, vật liệu CVK có khả phân hủy sinh học tạo sản phẩm cuối CO2, H2O Thử nghiệm 1: Vật liệu CVK tươi vật liệu CVK khô đặt môi trường rác thải sinh hoạt Tiến hành theo dõi qua 10 ngày, quan sát biến đổi màu sắc, trạng thái, độ bền, tượng nấm mốc vật liệu Để đối chứng kết thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm sử dụng chế phẩm vi sinh phân hủy chất thải hữu Sagi Bio vật liệu CVK Thành phần chế phẩm Sagi Bio gồm: Vi khuẩn xạ khuẩn ưa nhiệt, mật độ vi sinh vật hữu ích > 108 CFU/g chế phẩm Thử nghiệm 2: Dùng cốc thủy tinh loại 500 ml, cốc chứa vật liệu CVK dạng khô, cốc chứa vật liệu giấy (dạng cellulose thực vật), cốc chứa vật liệu nilon Cốc 2, dùng làm đối chứng Cân g vật liệu cho vào cốc, dùng PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 769 bơm tiêm hút ml nước cất phun cho ẩm vật liệu, tiếp tục dùng bơm tiêm hút ml chế phẩm vi sinh Sagi Bio phun trộn lên vật liệu Đậy cốc khăn xô tránh bụi bẩn đưa vào tủ ủ nhiệt, cài đặt nhiệt độ ủ 42 oC Tiến hành theo dõi chụp ảnh ngày lần, đồng thời phun chế phẩm để bổ sung Khả bao bọc bảo quản thực phẩm màng CVK tiến hành theo nghiên cứu Nguyễn Thúy Hương Trần Thị Tưởng An (2008), Nguyễn Xuân Thành cộng (2019): Lựa chọn mẫu thực phẩm giàu protein (mẫu thịt đỏ), mẫu quả, mẫu rau Mỗi loại gồm mẫu, mẫu không bao vật liệu gì, để tự nhiên mơi trường; mẫu bao màng CVK; mẫu bao vật liệu polyme dùng bao thực phẩm thông thường khác (túi nylon) Các thí nghiệm tiến hành điều kiện môi trường Nhiệt độ môi trường từ 20-25 oC, thời gian quan sát sau 4, 8, 12, 24 Các thí nghiệm lặp lại lần (n = 3), độ ẩm môi trường 80 % Theo dõi mẫu đến mẫu có tượng hỏng như: có mùi, có nấm mốc, màu sắc biến đổi,… Sử dụng màng CVK thử làm vật liệu gói kẹo, làm vật liệu nướng bánh nhiệt độ lò 280 oC để thử khả thẩm thấu, khả chịu nhiệt vật liệu CVK 2.3 Xử lý số liệu Các số liệu phân tích xử lý thông qua phần mềm Microsoft Excel 2010 biểu diễn dạng “số trung bình ± độ lệch chuẩn” ( ̅ ± SD) Những khác biệt coi có ý nghĩa thống kê giá trị p nhỏ 0,05 Mỗi cơng thức đo lặp lại lần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Cấu trúc vật liệu CVK Quan sát cấu trúc dạng sợi vật liệu CVK-MTC CVK-MTG ảnh chụp SEM mẫu Hình cho thấy vật liệu CVK gồm sợi cellulose có kích thước nano tạo mạng lưới cấu trúc không gian ba chiều với sợi đan xen nhau, sợi bề mặt màng có đồng Hình Ảnh chụp SEM vật liệu CVK-MTC CVK-MTG Với màng CVK tạo từ MTC (CVK-MTC), gồm sợi có cấu trúc ổn định, có kích thước nhau, đan xen tạo kích thước lỗ màng tương đương Trong khi, với loại màng CVK tạo từ MTG (CVK-MTG), gồm sợi có khác biệt so với CVK-MTC, BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 770 kích thước lỗ màng thay đổi, sợi màng có liên kết lỏng lẻo hơn, có nhiều điểm đứt gãy Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Xuân Thành cộng (2019) 3.2 Độ bền học vật liệu CVK Độ bền kéo đứt (MPa) độ giãn dài (%) xác định theo phương pháp phân tích ASTM D882 theo TCVN 1862-2-2010 (ISO 1924-2-2008) Bảng Độ bền học vật liệu CVK-MTC va CVK-MT (( ) Chỉ số Độ bền kéo đứt (MPa) Độ giãn dài (%) CVK-MTC 67,79 ± 5,76 5,10 ± 2,27 ,n ) CVK-MTG 26,25 ± 4,38 3,18 ±1,15 Kết Bảng cho thấy giá trị độ bền kéo đứt độ giãn dài vật liệu CVKMTC lớn vật liệu CVK-MTG Kết phù hợp với kết chụp mẫu SEM, vật liệu CVK-MTC có cấu trúc sợi không bị đứt gãy, bề mặt màng mịn Tuy nhiên, giá trị độ bền kéo đứt độ giãn dài CVK-MTC CVK-MTG nghiên cứu nhỏ so với nghiên cứu Nguyễn Xuân Thành cộng (2019) Điều giải thích độ dày màng thô vật liệu CVK dùng nghiên cứu (0,3 cm) nhỏ so với nghiên cứu trước (0,5 cm) Có lẽ q trình sinh tổng hợp tạo vật liệu CVK không làm cho màng CVK dày lên theo thời gian mà mật độ sợi tăng lên 3.3 Khả cản khuẩn vật liệu CVK Hình Khả cản khuẩn vật liệu CVK gạc vô khuẩn theo thời gian PHẦN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 771 Vi khuẩn nấm mốc phát triển nhanh môi trường chất dinh dưỡng thạch đĩa, thường sau đến ngày nấm mốc phát triển Do đó, để đánh giá khả cản khuẩn vật liệu CVK, tiến hành bọc màng vật liệu đĩa petri có mơi trường dinh dưỡng dạng thạch, theo dõi phát triển nấm mốc Trong điều kiện bề mặt thạch dinh dưỡng trải vi sinh vật chủng vi khuẩn S haemolyticus, E coli, nấm mốc qua ngày ngày thử nghiệm thu kết Hình cho thấy: ngày đầu tiên, chủng vi khuẩn mọc chậm, từ ngày thứ 2, vi khuẩn nấm mốc lên nhanh thích nghi mơi trường Quan sát bề mặt thạch cho kết quả: lật màng CVK-MTC, CVKMTG thấy điểm tiếp màng môi trường thạch không xuất vi khuẩn nấm mốc; lật lớp gạc vơ trùng cho thấy có vi khuẩn nấm mốc phát triển Kết thu cho thấy vật liệu CVK cản khuẩn tốt 3.4 Khả phân hủy sinh học vật liệu CVK Về kết thử nghiệm đặt vật liệu CVK môi trường rác thải sinh hoạt sau thời gian quan sát 10 ngày, nhận thấy màng CVK tươi dễ dàng bị phân hủy yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm vi sinh vật môi trường tự nhiên Màng bị lỗ chỗ, chuyển màu vàng nâu, có nấm mốc mọc bề mặt, dễ dàng bị đứt gãy phân hủy Màng CVK khô khó phân giải hơn, khơng bị thay đổi nhiều trạng thái màng tươi Vật liệu CVK dạng khô đặt ủ môi trường chế phẩm vi sinh phân hủy chất thải hữu Sagi Bio Hút dịch vi sinh theo tỉ lệ ml/1 g vật liệu CVK Nhỏ dịch vi sinh lên bề mặt vật liệu, đưa vào máy ủ ấm 42 oC Kết thu thử nghiệm sau tuần cho thấy: Vật liệu giấy có tượng bở bục; vật liệu CVK có tượng ngấm dịch, mềm dễ đứt so với ban đầu thử nghiệm, vật liệu nilon khơng có thay đổi hình thái 3.5 Khả bao bọc bảo quản thực phẩm vật liệu CVK Kết thử nghiệm khả bao bọc bảo quản vật liệu CVK thực phẩm trình bày Hình Hình Vật liệu CVK ứng dụng để bọc thịt, kẹo, nướng bánh Lựa chọn mẫu thực phẩm giàu protein (mẫu thịt đỏ) Gồm mẫu, mẫu đối chứng, mẫu bao màng CVK, mẫu bao vật liệu polyme khác (túi nylon) Các thí nghiệm tiến hành điều kiện Kết đánh giá cảm quan thu cho thấy khả giữ ẩm thực phẩm màng CVK tốt nhất; với thực phẩm bảo quản túi nylon, sản phẩm có ngưng tụ nước vật liệu polyetylen khơng có khả cho thoát nước; sản phẩm khơng bảo quản bị khơ bề mặt Sử dụng vật liệu CVK để thử nghiệm làm vật liệu gói kẹo, làm vật liệu nướng bánh bơng lan 772 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Đánh giá cảm quan cho thấy sau thời gian 30 ngày, viên kẹo bao bọc vật liệu CVK để ngồi mơi trường khơng khí (khơng cần đưa vào túi nylon) khơng bị chảy nước, vật liệu CVK không bị biến đổi màu sắc so với ban đầu Thử nghiệm dùng vật liệu CVK đựng bột bánh lan đem nướng nhiệt độ lị 280 oC, vật liệu CVK khơng bị thay đổi hình dáng màu sắc; thực phẩm bao bọc không bị thay đổi màu sắc, mùi vị KẾT LUẬN Chế tạo thành công vật liệu tự hủy sinh học CVK-MTC CVK-MTG có tính chất phù hợp để dùng màng ăn giúp bọc bảo quản thực phẩm Ảnh SEM cho thấy vật liệu CVK gồm sợi cellulose có kích thước nano tạo mạng lưới cấu trúc khơng gian ba chiều với sợi đan xen nhau, sợi bề mặt màng có đồng Độ bền kéo đứt độ giãn dài vật liệu CVK-MTC lớn vật liệu CVK-MTG Vật liệu CVK có khả tự hủy sinh học khả cản khuẩn tốt, có tiềm ứng dụng bao bọc bảo quản thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Azeredo, H M C., Rosa, M F., Mattoso, L H C., 2017 Nanocellulose in bio-based food packaging applications Ind Crops Prod., 97: 664-671 Hestrin, S and Schramm, M., 1954 Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum, Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose Biochem J., 58(2): 345-352 Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An, 2008 Thu nhận Bacteriocin phương pháp lên men tế bào Lactococcus lactic cố định chất mang cellulose vi khuẩn ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ, 11(9): 100-109 Islam, M U., Ullah, M W., Khan, S., Shah, N., Park, J K., 2017 Strategies for costeffective and enhanced production of bacterial cellulose Int J Biol Macromol., 102: 1166-1173 Padrao, J., Goncalves, S., Silva, J P., Sencadas, V., Lanceros, M S., Pinheiro, A C., Vicente, A A., Rodrigues, L R., Dourado, F., 2016 Bacterial cellulose-lactoferrin as an antimicrobial edible packaging Food Hydrocoll., 58: 126-140 Nguyễn Xuân Thành, 2019 Nghiên cứu số đặc tính màng 3D-nano-cellulose hấp phụ berberin định hướng dùng bọc thực phẩm tươi sống Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 202(09): 45-52 Nguyễn Xuân Thành, Trần Thị Lan Dung, Phạm Thùy Dung, Nguyễn Hải Đăng, 2019 Chế tạo màng bọc thực phẩm đa thay túi nilon từ vật liệu 3D-nano-cellulose berberin Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên, 197(04): 45-51 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 1862-2:2010 (ISO 1924-2:2008) giấy cáctông - Xác định tính chất bền kéo Xuất lần 4, Hà Nội ... số Độ bền kéo đứt (MPa) Độ giãn dài (%) CVK-MTC 67,79 ± 5,76 5,10 ± 2,27 ,n ) CVK-MTG 26,25 ± 4 ,38 3,18 ±1,15 Kết Bảng cho thấy giá trị độ bền kéo đứt độ giãn dài vật liệu CVKMTC lớn vật liệu