Nhóm N Công ty luật Minh Khuê www luatminhkhue vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5285 1990 THỨC ĂN CHĂN NUÔI PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDRAT CACBON HÒA TAN VÀ DỄ THỦY PHÂN BẰNG THUỐC THỬ ANTRON Animal[.]
Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5285:1990 THỨC ĂN CHĂN NUÔI PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDRAT CACBON HÒA TAN VÀ DỄ THỦY PHÂN BẰNG THUỐC THỬ ANTRON Animal feeding stuffs Method for determination of soluble and hydrolysable cacbonhydrates content by antrone reagent Tiêu chuẩn áp dụng tất loại thức ăn chăn ni có nguồn gốc thực vật; quy định phương pháp xác định hàm lượng hydrat cacbon hòa tan hydrat cacbon dễ thủy phân thuốc thử antron Nguyên tắc phương pháp Phương pháp dựa việc chiết hydrat cacbon hòa tan (đường) từ mẫu thử nước cất nhiệt độ 50 - 60oC, sau thủy phân hydrat cacbon dễ thuỷ phân (tinh bột) phần lại dung dịch axit sunfuric loãng tiến hành xác định đường dịch chiết dịch thủy phân thuốc thử antron Dưới tác dụng axit sunfuric đậm đặc phân tử đường bị nước tác dụng với antron tạo hợp chất có màu xanh nhạt Đo mật độ quang dung dịch máy so màu fek với kính lọc màu đỏ hay máy “Spekol” bước sóng (625 ± 15) nm Lấy mẫu Lấy mẫu để thử theo TCVN 4325-86 Dụng cụ hoá chất 3.1 Dụng cụ - Máy so màu fek hay “Spekol” hay loại tương tự; - Máy cắt mẫu thực vật; - Máy nghiền mẫu; - Tủ sấy; - Cân phân tích có độ xác đến 0,0002 g; - Bếp cách thủy; - Bếp điện; - Rây với đường kính lỗ rây 1mm theo TCVN 2230-77; - Giá ống nghiệm kim loại; - Ống nghiệm thuỷ tinh có nút mài, đường kính cm; - Máy lắc với tần số 200 dao động/phút; - Cốc đốt dung tích 250 ml có vạch mức 50 - 60 ml; - Bình định mức có nút mài, dung tích 100; 1000 ml; - Phiễu lọc sứ; - Bình Bunden; - Thiết bị hút chân không; - Phễu thuỷ tinh đường kính cm; - ống đong dung tích 100; 250; 500; 1000 ml; - Bình nón dung tích 150 - 200 ml; - Pipet dung tích 1, 2, 5, 10, 20, 25ml; - Bộ định lượng dung tích 10 ml; - Cối chày sứ; - Đũa thuỷ tinh; LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn - Giấy lọc nhanh 3.2 Hoá chất - Antron, TK; - Thioure, TKPT; - Axit sunfuric đậm đặc (d = 1,84g/ml) TKPT hay TKHH; - Gluco (khan), TK; - Kẽm sunfat ngậm bảy phân tử nước ZnSO4.7 H2O hay kẽm axetat ngậm phân tử nước Zn(CH3COO)2 2H2O, TKPT hay TKHH; - Kali feroxianua ngậm ba phân tử nước K4Fe(CH)6 H2O, TKPT hay TKHH; - Thuỷ ngân (II) clorua, TKPT hay TKXH; - Toluen, TKHH; - Benzen, TKHH; - Etepetrol, TKPT; - Canxi clorua khan, TK; - Nước cất hay nước có độ tương đương Chuẩn bị thuốc thử dung dịch 4.1 Tinh chế antron Antron loại TK cần thiết phải tinh chế lại Việc tinh chế tiến hành tủ hút Hịa tan 10g antron 90ml benzen sơi, khuấy nhanh đến nhận dung dịch suốt màu nâu Cho thêm 30 ml ete petrol cách nhỏ từ từ giọt ete, vừa nhỏ vừa khuấy Rót dung dịch lên phễu lọc sứ nối với bình Bunden thực lọc chân khơng Những tinh thể antron kết tinh lại phễu, cho bay hết ete tủ hút sau đặt vào bình hút ẩm với chất hút ẩm canxi clorua bay hết mùi dung môi Nếu hòa tan antron Benden mà thu dung dịch đục loại antron có chất lượng không tốt Antron tinh chế cho vào lọ nâu, bảo quản tủ lạnh 4.2 Chuẩn bị thuốc thử antron Trộn 300 ml nước cất với 760 ml axit sunfuric đậm rót cẩn thận axit vào nước, vừa rót vừa khuấy Sau làm lạnh dung dịch, cho thêm 1g thioure, 1g antron tinh chế khuấy đến tan hết Dung dịch nhận có màu vàng chanh chuyển vào lọ nâu, có nút mài bảo quản tủ lạnh không hai tuần 4.3 Chuẩn bị dung dịch làm sáng màu a- Hoà tan 300 g kẽm sunfat hay 230 g kẽm axetat nước cất bình định mức dung tích 1000 ml, thêm nước cất đến vạch trộn b- Hoà tan 150 g kali feroxianua nước cất bình định mức dung tích 1000 ml, thêm nước cất đến vạch mức trộn 4.4 Chuẩn bị dung dịch axit sunfuric 1%: Trộn 5,6 ml axit sunfuric đậm đặc với nước cất bình định mức dung tích 1000 ml, rót axit vào nước, làm lạnh dung dịch đưa thể tích đến vạch mức nước cất trộn 4.5 Chuẩn bị dung dịch gốc gluco Hịa tan 0,3 g gluco khan bình định mức dung tích 1000 ml nước cất đun sơi để nguội Thêm vào vài tinh thể thủy ngân (II) clorua Dung dịch bảo quản tủ lạnh khơng q tháng Nếu khơng có thủy ngân (II) clorua cho vài giọt toluen bảo quản tủ lạnh không tuần 4.6 Chuẩn bị thang dung dịch chuẩn: Thang dung dịch chuẩn chuẩn bị bình định mức dung tích 100 ml cách rót vào bình lượng dung dịch gốc gluco theo bảng 1, đưa thể tích dung dịch đến vạch mức nước cất trộn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Bảng Thể tích dung dịch gốc gluco (ml) Lượng gluco có 2ml dung dịch chuẩn (mg) 0,03 10 0,06 15 0,09 20 0,12 25 0,15 Chuẩn bị mẫu thử Mẫu cỏ khô, rơm rạ, thức ăn ủ chua, thức ăn xanh cắt thành đoạn dài 1-3 cm Thức ăn củ cắt thành mỏng có độ dày 0,8 cm Đảo mẫu cắt mặt phẳng từ chỗ khác lấy khối lượng mẫu để cho sau sấy có khoảng 100 g Sấy mẫu tủ sấy nhiệt độ 60 - 65oC đến khối lượng không đổi (trạng thái khơ khơng khí), nghiền máy sàng qua rây có đường kính lỗ rây 1mm Phần lại rây nghiền lại cối sứ, bổ sung vào phần sàng trộn Mẫu thức ăn hỗn hợp, hạt ngũ cốc, khô dầu, bột từ thân xanh nghiền nhỏ sàng qua rây có đường kính lỗ rây 1mm Mẫu chuẩn bị bảo quản bình thủy tinh hay bình polyetylen có nút đậy kín, để nơi khô sử dụng để tiến hành phân tích Tiến hành thử 6.1 Chiết hydrat cacbon hịa tan Cân 0,5 g mẫu trạng thái khô không khí (theo mục 5) với độ xác đến 0,0002 g chuyển vào bình nón dung tích 150 - 200 ml Rót vào bình 60 ml nước cất đun nóng đến 50 - 60 oC Đặt bình vào máy lắc tiến hành lắc với tần số 200 dao động/ phút thời gian 15- 20 phút Lọc dung dịch qua phễu thuỷ tinh với giấy lọc mềm vào bình định mức dung tích 100 ml Phần cịn lại giấy lọc rửa 2-3 lần lượng nước cất không nhiều Sau làm lạnh đưa thể tích dung dịch đến vạch mức nước cất lắc Dung dịch nhận phần nước chiết ban đầu hydrat cacbon hòa tan 6.2 Thủy phân hydrat cacbon dễ thủy phân Phần lại giấy lọc sau chiết hydrat cacbon hòa tan (theo mục 6.1) chuyển cẩn thận vào cốc thủy tinh chịu nhiệt dung tích 250 ml 50 ml dung dịch nóng axit sunfuric 1% Đun sơi cốc bếp điện phút, khuấy cho lượng mẫu bám thành cốc Sau lọc phần dịch nóng qua phễu thuỷ tinh vào bình định mức dung tích 100 ml; tráng cốc nước cất rót lên phễu Phần cịn lại giấy lọc rửa nước cất Sau làm lạnh, đưa thể tích dịch lọc đến vạch mức nước cất lắc Dung dịch nhận trường hợp dịch thủy phân ban đầu hydrat cacbon dễ thuỷ phân Dịch chiết dịch thủy phân bảo quản tủ lạnh khơng q ngày 6.3 Làm sáng màu dung dịch Việc làm sáng màu dịch chiết (mục 6.1) dịch thủy phân (mục 6.2) tiến hành cách hút 120 ml dung dịch (tùy theo hàm lượng đường) cho vào bình định mức dung tích 100 ml, rót thêm nước cất đến khoảng 2/3 thể tích bình thêm tiếp ml dung dịch kẽm sunfat hay kẽm axetat, 2ml dung dịch kali feroxianua Dung dịch bình xuất kết tủa vơ định hình, thêm nước cất đến vạch mức, trộn để yên 20 phút, lắc Sau lọc dung dịch qua giấy lọc vào bình định mức dung tích 100 ml, bỏ vài giọt đầu Nếu mẫu thử có hàm lượng hydrat cacbon thấp việc làm sáng màu tiến hành trực tiếp với dịch chiết dịch thuỷ phân đầu mẫu thử mà không cần định mức chúng Các dung dịch làm sáng màu bảo quản tủ lạnh không ngày 6.4 Tạo màu đo độ quang Việc tạo màu dịch chiết, dịch thủy phân mẫu thử dung dịch thang chuẩn gluco tiến hành ống nghiệm chịu nhiệt có nút mài Dùng pipet với bóp cao su cho vào ống nghiệm 10 ml thuốc thử antron Sau đó, đợt phân tích thêm tiếp ml dịch chiết làm sáng màu vào ống thứ nhất- ml dịch thủy phân làm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn sáng màu vào ống thứ hai - ml dung dịch chuẩn gluco vào ống thứ ba ống Đậy nút ống nghiệm lại, cẩn thận lắc Các dung dịch phải suốt Nếu dung dịch nhận bị đục cần thêm tiếp lượng thuốc thử antron vào tất ống nghiệm không vượt 15 ml cho ống Nhanh chóng mở nút, cho ống nghiệm vào giá kim loại đặt vào nồi cách thủy sôi (nhất thiết phải sôi) Tiến hành đun sôi 20 phút, đun dung dịch ống nghiệm xuất màu xanh Đậy nút ống nghiệm, làm lạnh vòi nước sau 30 phút đo mật độ quang dung dịch phân tích dung dịch chuẩn máy so màu fek hay “spekol” bước sóng (625 ± 15) nm với cuvet có chiều dày 20 nm Màu dung dịch đo bền vững ngày Dung dịch đối chứng dung dịch mẫu trắng chuẩn bị cách thay ml dung dịch chuẩn gluco 2ml nước cất, thêm tiếp 10 hay 15 ml thuốc thử antron đun sôi nồi cách thủy 20 phút với mẫu phân tích Hàm lượng hydrat cacbon mẫu thử xác định theo đồ thị chuẩn - đồ thị xây dựng dựa vào kết đo mật độ quang dung dịch chuẩn gluco, với trục hồnh lượng gluco có ml dung dịch chuẩn (mg) trục tung giá trị mật độ quang tương ứng chúng Giá trị mật độ quang đo cần nằm khoảng 0,15-0,60 Nếu việc đo nhận giá trị mật độ quang lớn cần pha lỗng dung dịch lấy để tạo màu nhận giá trị thấp cần tăng lượng mẫu thử đem phân tích Tính tốn kết 7.1 Hàm lượng hydrat cacbon hòa tan (đường) mẫu thử (X) biểu thị % tính theo cơng thức: Trong đó: n - Lượng đường dịch chiết tính theo đồ thị chuẩn, tính mg/ 2ml; V- Thể tích ban đầu chưa làm sáng màu dịch chiết, tính ml; V1 - Thể tích dịch chiết làm sáng màu, tính ml; V2 - Thể tích ban đầu dịch chiết lấy để làm sáng màu, tính ml; V3 - Thể tích dịch chiết làm sáng màu lấy để tạo màu, tính ml; m - Khối lượng mẫu thử, tính mg; 100 - quy đổi tỷ lệ phần trăm 7.2 Hàm lượng hydrat cacbon để thủy phân (tinh bột) mẫu thử (X 1) biểu thị % tính theo cơng thức: Trong đó: n - Lượng đường dịch thủy phân tính theo đồ thị chuẩn, tính mg/ 2ml; V- Thể tích ban đầu chưa làm sáng màu dịch thủy phân, tính ml; V1 - Thể tích dịch thủy phân làm sáng màu, tính ml; V2 - Thể tích ban đầu dịch thủy phân lấy để làm sáng màu, tính ml; V3 - Thể tích dịch thủy phân làm sáng màu lấy để tạo màu, tính ml; m - Khối lượng mẫu thử, tính mg; 100 - Quy đổi tỷ lệ phần trăm; 0,9 - Hệ số chuyển lượng gluco tinh bột 7.3 Kết cuối trị số trung bình hai lần xác định song song Sự sai khác cho phép hai lần xác định song song phụ thuộc vào hàm lượng hydrat cacbon có mẫu không vượt trị số nêu bảng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Bảng Hàm lượng hydrat cacbon Sư sai khác cho phép hai lần xác định song song 1-6,0 0,50 6,1-12,0 0,80 12,1-25,0 1,20 25,1-45,0 2,00 45,1-75,0 3,30 7.4 Hàm lượng hydrat cacbon hòa tan hay hydrat cacbon để thủy phân (X 2) biểu thị % dạng vật chất khơ tính theo cơng thức: hay Trong : X hay X1 - lượng hydrat cacbon hòa tan hay để thủy phân mẫu thử dạng khô khơng khí, tính %; W - độ ẩm mẫu thử, tính % LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 ... vào ống thứ ba ống Đậy n? ?t ống nghiệm lại, c? ?n th? ?n lắc Các dung dịch phải suốt N? ??u dung dịch nh? ?n bị đục c? ?n thêm tiếp lượng thuốc thử antron vào tất ống nghiệm không vượt 15 ml cho ống Nhanh... tinh thể thủy ng? ?n (II) clorua Dung dịch bảo qu? ?n tủ lạnh khơng q tháng N? ??u khơng có thủy ng? ?n (II) clorua cho vài giọt toluen bảo qu? ?n tủ lạnh không tu? ?n 4.6 Chu? ?n bị thang dung dịch chu? ?n: ... antron Benden mà thu dung dịch đục loại antron có chất lượng không tốt Antron tinh chế cho vào lọ n? ?u, bảo qu? ?n tủ lạnh 4.2 Chu? ?n bị thuốc thử antron Tr? ?n 300 ml n? ?ớc cất với 760 ml axit sunfuric