LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu chế tạo hệ dẫn thuốc nano paclitaxel phối hợp curcumin và đánh giá tác động của chúng lên các tế bào ung thư

TỔNG QUAN

Tổng quan về ung thư

Ung thư là một thuật ngữ chung cho một nhóm lớn các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể Các thuật ngữ khác được sử dụng là các khối u ác tính và u ột đặc tính của ung thư là tạo nhanh các tế bào bất thường phát triển vượt ra ngoài phạm vi thông thường của chúng, và sau đó có thể xâm nhập vào các bộ phận liền kề của cơ thể và lây lan đến các cơ quan khác, quá trình thứ hai được gọi là di căn Di căn là những nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư

Tỷ lệ ung thư có xu hướng tăng nhanh ở phần lớn các nước trên thế giới Tổ chức Y tế thế giới(WHO) nhận định đây là đại dịch đang xảy ra trong hiện tại Ước tính mỗi năm trên toàn cầu có hơn 14,1 triệu người mới mắc và 8,2 triệu người chết do ung thư, trong đó gần 70% là ở các nước đang phát triển và có thể tăng gấp đôi lên 14,6 triệu người vào năm 2035 Số lượng các trường hợp mới mắc được dự kiến sẽ tăng khoảng 70% trong 2 thập kỷ tới

Hiện khoảng 23 triệu người đang sống với ung thư Nếu không có các biện pháp can thiệp kịp thời thì các con số này sẽ tăng lên 30 triệu vào năm 2020

Và cũng theo WHO, trong 178 quốc gia, vùng lãnh thổ có tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư nhiều nhất thế giới, Việt Nam đứng thứ 78 Năm bệnh ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam là ung thư gan, phổi, dạ dày, ung thư vú và ung thư trực tràng [15]

Các phương pháp điều trị ung thư phổ biến hiện nay là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị Trong hóa trị liệu, các dược chất phổ biến như cisplatin, mitoxantron, estramustin, doxorubicin, etoposid, vinblastin, paclitaxel,vinorelbin, hoặc kết hợp các loại thuốc với nhau đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư và cũng đã cải thiện chất lượng cuộc sống [8,31,34] Tuy nhiên, bên cạnh hiệu quả trong diệt tế bào ung thư, các thuốc này còn gây nhiều tác dụng không mong muốn trên tế bào lành Do đó, công cuộc tìm kiếm các thuốc mới, các liệu pháp điều trị mới, hoặc phối hợp các dược chất với nhau để nâng cao hiệu quả điều trị, giảm thiểu tác dụng không mong muốn vẫn đang là một thách thức đặt ra với các nhà khoa học Do đó, một nhu cầu cấp bách là cần tìm ra phương pháp điều trị ung thư không có hoặc rất ít tác dụng phụ đến các cơ quan bình thường.

Tổng quan về hệ phân phối thuốc mới - hệ nano

Nhiều hệ phân phối thuốc đã và đang được nghiên cứu và phát triển nhằm tăng khả năng vận chuyển và giải phóng thuốc tại những vùng khối u mang bệnh và do đó giảm thiểu những tác động xấu tới những cơ quan của cơ thể Trong đó hệ phân phối thuốc nano có tiềm năng ứng dụng rất cao, thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu và phát triển

Công nghệ nano liên quan đến việc thiết kế, phân tích, bào chế các vật liệu trong đó có ít nhất một chiều có kích thước từ 1-100 nm Các vật liệu nano có diện tích bề mặt lớn so với thể tích, các tính chất hóa, lý, sinh học của chúng cũng rất khác biệt so với các vật liệu có kích thước lớn Những tính chất siêu việt này đã mở ra những cơ hội mới trong việc ứng dụng công nghệ nano trong các lĩnh vực như y học và sinh học Nhờ đó, thuật ngữ “y học nano” đã được hình thành [28] Mục tiêu của y học nano là áp dụng của công nghệ nano vào y học cho việc phòng bệnh, chẩn đoán và trị liệu bằng cách dùng vật liệu nano để thao tác các hệ thống sinh học ở mức độ tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở cấp độ phân tử Những nghiên cứu trong y học nano phần lớn liên quan đến việc mang thuốc đến các tế bào bệnh và chẩn đoán bệnh ở mức phân tử Với kích thước cỡ nano mét, các hệ phân phối thuốc nano không chỉ giúp cải thiện tính tan của các thuốc không tan mà còn có khả năng tập trung thuốc tại vùng khối u thông qua hai cơ chế hướng đích: bị động và chủ động

Hình 1: Cơ chế nhắm đích bị động và chủ động của hệ phân phối thuốc có kích thước nano

1.2.1 Cơ chế hướng đích của hệ phân phối thuốc nano

Các nhà khoa học đã nhận thấy có sự khác biệt giữa vùng mô bình thường khoẻ mạnh và mô ung thư, tế bào của vách huyết quản trong vùng mô khoẻ mạnh có sự liên kết rất khít khao, trong khi đó ở vách huyết quản của mô ung thư xuất hiện những khoảng hở có kích cỡ khoảng 600-800 nm Phân tử thuốc tự do có thể đi xuyên vách thông qua sự thẩm thấu và khuếch tán tự động, có tác dụng và tiêu diệt các tế bào khỏe mạnh lẫn tế bào ung thư mà không phân biệt Ngược lại, nếu thuốc đưa vào cơ thể dưới dạng hạt có kích thước nano, độ lớn của hạt không cho nó đi qua vách huyết quản của mô bình thường nhưng có thể chui lọt qua những khoảng hở đi vào khối u ung thư [5]

Các nhà toán học còn có thể tính toán hình dạng tối ưu làm sao để hạt có thể

Tế bào nội mô Hoạt chất có hoạt tính

Hướng đích chủ động Nhập bào

Giải phóng hoạt chất trong tế bào

Hướng đích bị động Mạch bạch huyết chui qua kẽ hở huyết quản với số lượng tối đa Từ đó làm gợi ý đến việc nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị ung thư được bọc trong các hạt kích thước nano nhằm tăng tính hướng đích, dẫn đến tăng hiệu quả điều trị bệnh

Khi được đưa vào cơ thể, hạt nano mang thuốc sẽ theo hệ thống tuần hoàn qua mạch máu để đến mô đích Kích cỡ của hạt mang thuốc là một yếu tố quan trọng cho việc vận chuyển thuốc Kích cỡ này phải trong phạm vi từ 4 đến 400 nm Nếu nhỏ hơn 4 nm, hạt sẽ nhanh chóng bị thải ra theo đường bài tiết Nếu lớn hơn 400 nm, hạt sẽ bị hệ thống miễn dịch phát hiện và loại trừ ra khỏi cơ thể

Cơ chế hướng đích chủ động dựa trên những liên kết đặc hiệu cuả các thụ thể có mặt trên tế bào ung thư đối với các tác nhân hướng đích đặc hiệu đối với các thụ thể đó ối loại tế bào ung thư sẽ có một hoặc nhiều thụ thể đặc hiệu Để đạt được khả năng nhắm đích có tính chọn lọc cao, những hệ phân phối thuốc có thể được gắn với các yếu tố hướng đích như: hormon, kháng thể, và những dẫn xuất của vitamin [27] Trong đó hệ gắn thuốc với axit olic được nghiên cứu ứng dụng nhiều trị liệu ung thư [24]

Axit folic (Hình 2) là một vitamin rất cần thiết cho các quá trình sinh tổng hợp nucleotid, vì vậy, nó được sử dụng để kéo dài quá trình sống của tế bào Tế bào thường vận chuyển folat qua màng thông qua những thụ thể của folat (folat-receptor ( )) Những thụ thể của folat ( ) thường được biểu hiện quá mức ở tế bào ung thư giúp những tế bào ác tính được cung cấp đầy đủ nhu cầu vitamin cho sự phát triển của chúng [33]

Thụ thể olat của người (khối lượng cỡ 38 kDa) bao gồm 3 dạng - ,

- , và - ỗi dạng có khả năng bám dính khác nhau đối với olat

Hằng số phân ly K D của mỗi dạng đối với olat lần lượt là: FR- = 0,1 n , FR- = 1 n , - = 0,4 n Hằng số phân ly càng nhỏ cho thấy khả năng bám dính càng cao Vì có ái lực cao đối với olat, nên thụ thể - là đối tượng được nghiên cứu khá kĩ trên các dòng tế bào ung thư - chỉ biểu hiện ở mức độ rất thấp trên các mô thường, song lại biểu hiện rất cao ở các mô thư ác tính như: ung thư buồng trứng, ung thư dạ con, ung thư não, thận… ức độ biểu hiện của thụ thể olat được biểu hiện qua lượng olat bám trên một mg protein được tách ra từ các mô, khối u tương ứng Mức độ biểu hiện của thụ thể folat ở mô khối u cao hơn nhiều so với mô lành (Hình 3) Các nhà khoa học có thể tận dụng các đặc điểm này để gắn folat lên các hệ phân phối thuốc, giúp tăng khả năng bám dính của những hệ dẫn thuốc này lên tế bào ung thư, qua đó tăng nồng độ của thuốc tại những vùng khối u và giảm thiểu nồng độ của thuốc tại những cơ quan, tế bào lành

Hình 3: M c độ bi u hiện củ th th t t ên m thư ng và khối u

Cơ chế: Sau khi bám lên những thụ thể folat nằm trên bề mặt của tế bào ung thư, những hệ gắn folat sẽ được tiếp nhận và vận chuyển vào bên trong tế bào, tới những cơ quan nội bào gọi là endosom Những endosom này có pH nằm trong khoảng từ 4.3 đến 6.9, phổ biến nhất là 5.0 pH của endosom có ảnh hưởng tới việc gắn của hệ olat vào thụ thể Khi pH < 5 một số hệ gắn folat sẽ bị tách ra khỏi thụ thể folat và tồn tại bên trong tế bào Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, tổng số hệ gắn folat được nhập bào sẽ gần như tỉ lệ thuận với số lượng thụ thể folat được biểu hiện trên một tế bào và tốc độ tiếp nhận những hệ gắn folat của một tế bào ung thư trung bình là 1-3  10 5 phân tử tế bào giờ [42]

 Kết hợp copolyme và folat để tạo ra một hệ phân phối thuốc cấu trúc nano có khả năng hướng đích chủ động

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành dựa trên việc kết hợp copolyme và olat để tạo ra các hệ phân phối thuốc nano hướng đích mang lại nhiều tác dụng có lợi như các liposom, phức hợp polymer-thuốc, hạt nano lipid, và micel copolymeric Ví dụ, năm 2011, ing - Fa - Hsieh cùng đồng nghiệp đã tiến hành tổng hợp hệ phân phối thuốc nano doxorubicin dựa trên copolyme poly(ethylen glycol)-poly )-poly(ethylen glycol) gắn yếu tố hướng đích olat ứng dụng trong điều trị ung thư vú [11] Hay Wang J, Liu W cùng các cộng sự năm 2011 cũng đã tiến hành tổng hợp hệ phân phối thuốc có yếu tố hướng đích olat được tổng hợp từ monomethoxy-poly(ethylen glycol)- b-poly(lactid)-paclitaxel (MPEG-PLA-paclitaxel) và d- -tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS)- olat đã chứng minh acid folic tăng cường khả năng phân phối thuốc của hệ nano mang thuốc điều trị ung thư đến các tế bào ung thư [47]

1.2.2 Các vật liệu có thể dùng để tạo ra chất mang nano Để chế tạo được những hệ phân phối thuốc điều trị ung thư có khả năng nhắm đích tới tế bào ung thư như vậy, có hai vấn đề lớn được đặt ra Thứ nhất, những loại vật liệu nào phù hợp để có khả năng tạo ra những hệ chất mang có kích thước nano, có khả năng tương hợp sinh học cao, an toàn cho người bệnh Thứ hai, lựa chọn những phối tử nào đặc hiệu đối với những thụ thể đặc trưng đối với từng loại tế bào ung thư là việc rất quan trọng quyết định tới khả năng nhắm đích và tính chọn lọc của việc điều trị

Những hệ vật liệu sử dụng để bào chế những hệ phân phối thuốc phải có khả năng tương thích sinh học cao, bảo vệ thuốc chống lại các quá trình chuyển hóa và thải trừ trong cơ thể thông qua sự hoạt động của các loại enzyme, không gây những phản ứng miễn dịch trong cơ thể và không gây độc cho cơ thể Có thể chia những vật liệu được sử dụng trong việc dẫn truyền thuốc làm 3 loại [23]:

- Các hạt vô cơ có cấu trúc xốp ( hạt SiO 2 xốp) hoặc rỗng ( hạt vàng rỗng)

- Các loại polyme thiên nhiên hoặc polyme tổng hợp

- Các hệ mang sinh học: virus Một số hệ phân phối thuốc được tạo thành từ polyme được liệt kê trong Hình 4 Trong số đó, các polyme được sử dụng để tạo chất mang nano dưới dạng polymeric micel Trong đó các polyme phân hủy sinh học vẫn được sử dụng rộng rãi hơn cả Các polyme phân hủy sinh học như poly- caprolacton (PCL), poly lactid (PLA), poly glycolic acid (PGA), poly e-caprolacton, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) Những polyme này đã được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FDA, chứng minh là phân hủy sinh học, được sử dụng trong nhiều nghiên cứu do có độc tính thấp với cơ thể Với tính chất kỵ nước giúp chúng có khả năng vận chuyển những loại thuốc ít tan trong nước lớn nhưng đồng thời khả năng phân tán trong nước rất hạn chế, và tốc độ phân hủy thấp trở thành rào cản để sản xuất hệ phân phối thuốc mới tiên tiến [46] Vì vậy, thông thường, khi sử dụng các loại polyme này như một hệ phân phối thuốc, người ta thường sử dụng các chất nhũ hóa nhằm làm tăng khả năng phân tán của hệ trong môi trường cơ thể, qua đó làm tăng khả năng lưu thông trong hệ tuần hoàn ặc dù vậy, khi sử dụng các chất nhũ hóa, kích thích của hệ mang thuốc thường lớn, không nằm trong vùng kích thước từ 200-800 nm Vì vậy, chúng dễ bị bắt giữ bởi các đại thực bào và bị phân hủy bởi các enzyme trong hệ thống bài tiết của cơ thể Đồng thời, với kích thước lớn, khả năng phân tán của những hệ phân phối thuốc này vào những vùng khối u ung thư bị giảm xuống

Hình 4: Một số hệ phân phối thuốc c u t úc n n [37] Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học đã tạo ra những copolyme Micel copolyme hoạt động như các chất mang nano với nhiều thuận lợi, chẳng hạn như có độc tính thấp, tính ổn định cao và kích thước nhỏ

Copolyme lưỡng tính, trong công thức gồm các cấu trúc kỵ nước và ưa nước

Trong môi trường nước, chúng có thể tự tập hợp thành những cấu trúc vỏ- lõi

Hạt nano polyme Micel polyme

Phức hợp polyme - thuốc/protein được gọi là micel copolymeric (Hình 5) Lõi kỵ nước có thể được coi như là vi môi trường để kết hợp các loại thuốc kỵ nước và bảo vệ chúng khỏi bị phá hủy trong khi lớp vỏ tham gia vào việc ổn định và cải thiện thời gian lưu của các micel trong các hệ thống tuần hoàn [9]

Hệ phân phối thuốc nano mang đồng thời Paclitaxel và Curcumin dựa trên copolyme PLA-TPGS ((Cur+PTX)-PLA-TPGS)

PTX (Hình 6) được chiết xuất từ vỏ cây Taxus brevifolia, là một trong những chất trị liệu hóa học hiệu quả nhất trong điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư buồng trứng, vú, đại tràng, bàng quang, thực quản, phổi, đa u tủy và ung thư Kaposi [41].Tuy nhiên, do độ hòa tan kém (độ tan dưới 0,5mg/L) và chỉ số điều trị thấp, ứng dụng lâm sàng của PTX là vẫn còn hạn chế Bệnh nhân sau khi dùng PTX đều bị rụng tóc, hơn 90% bênh nhân bị suy tủy Một số bệnh nhân bị các phản ứng phụ như như sung huyết, ngoại ban (39%), kém ăn (25%), phù ngoại biên (10%)[13]

Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao nâng cao tính tan, nâng cao hiệu quả trị liệu của PTX đồng thời làm giảm những hiệu ứng phụ do loại thuốc này gây ra Theo Sang Cheon Lee và cộng sự, copolyme dựa trên poly ethylen glycol và poly(2-(4-vinylbenzyloxy)-N,N-diethylnicotinamid) đã có tác dụng làm tăng độ tan của PTX [25]

Hình 6 C ng th c hó học củ PTX

Curcumin (Cur) [1,7-Bis (4-hydroxy-3-medithoxyphenyl) -1,6- heptadien-3,5-dion] (Hình 7), một hợp chất màu vàng phân lập từ thân rễ cây nghệ Curcuma longa Cur nhận được sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học vì khả năng phòng ngừa ung thư của nó [6,19]

Bột nghệ từ lâu đã được sử dụng trong ẩm thực Ấn Độ và trong y học truyền thống châu Á để điều trị chứng khó tiêu hóa và viêm khớp Curcumin

Hình 7 C ng th c hó học của Cur chiết xuất từ củ nghệ không chỉ là một chất chống oxy hóa mạnh, một hợp chất chống viêm mà còn có tác dụng phòng và điều trị ung thư Nhiều sản phẩm từ curcumin đã được tổng hợp để điều trị ung thư (ung thư ruột, da, vú, dạ dày, buồng trứng, tuyến tiền liệt, dạ dày, loét tá tràng, vv) [1,2,10,44] ặc dù curcumin đã được chứng minh là không độc hại và có các tác dụng chống ung thư đầy hứa hẹn nhưng ứng dụng của nó vẫn bị hạn chế do khả năng hòa tan trong nước và sinh khả dụng kém [48] Theo kết quả nghiên cứu của Donatella Paolino và các cộng sự được công bố vào năm 2016, sử dụng copolyme methacrylic có thể làm tăng độ tan cũng như sinh khả dụng đường uống của curcumin [32]

1.3.3 Tác dụng hiệp đồng của Curcumin và Paclitaxel

Một số nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm ra rằng liệu có bất cứ tác dụng hiệp đồng nào giữa Cur và PTX hay không Và kết quả của những nghiên cứu này chỉ ra rằng thực sự giữa chúng có tác dụng hiệp đồng để làm tăng hiệu quả ức chế khối u qua trung gian NF-kappa B (NF-κB )

NF-κB là một protein phức tạp, có vai trò kiểm soát sự phiên mã của ADN, sự sản xuất cytokin, đáp ứng miễn dịch, trong nhiễm trùng virus và khả năng sống của tế bào chúng có mặt trong rất nhiều loại tế bào người và động vật Trong các tế bào bình thường, thì NF-κB không được hoạt hóa nên đáp ứng của tế bào với quá trình apoptosis (quá trình tế bào tự chết theo chương trình) vẫn diễn ra bình thường Đó là bởi vì N -κB hoạt hóa sẽ kiểm soát gen anti-apoptosis đặc biệt là T A 1 và T A 2, do đó loại bỏ hoạt động của họ enzym caspase - đóng vai trò chính trong các quá trình apoptosis Việc ức chế NF-κB có thể làm tế bào ngừng phân chia, tăng trưởng, gây chết hoặc trở nên nhạy cảm hơn với các thuốc điều trị ung thư [23]

Hầu hết các chất điều trị ung thư đều hoạt hóa NF-kappa B trong đó có PTX Và Cur thì đã ức chế PTX trong quá trình hoạt hóa N -kappa B và làm tăng hiệu quả ức chế khối u tăng sinh của PTX trong dòng tế bào ung thư vú

MDA-MB-231 Sự kết hợp của Cur và PTX cho phép suy ra sự ức chế tốt hơn về sự tăng sinh tế bào, làm tế bào tự chết theo chương trình nhiều hơn khi so sánh với việc chỉ dùng hoặc PTX hoặc Cur đơn thuần [18]

1.3.4 Tổng quan về hệ micel copolyme PLA-TPGS

Poly-lactic acid (PLA) (Hình 8) là một polyme phân hủy sinh học và tương thích sinh học, được sử dụng rộng rãi trong y sinh học để làm cho chất mang nano an toàn và phân hủy sinh học để điều trị ung thư Cục Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ ( DA) đã chấp thuận sử dụng của chúng trong các hệ thống phân phối thuốc Các monome của PLA tức là, L-lactic acid (L-LA), mà có thể được tạo ra một cách hiệu quả bởi việc lên men từ các nguồn tái tạo được như tinh bột và đường PLA phân hủy đến monome của nó, L-LA, là một chất chuyển hóa bình thường của con người [46]

TPGS (D- -tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat) (Hình 9) được DA chấp thuận là dẫn xuất tan trong nước tự nhiên của Vitamin E (PEGylated vitamin E) TPGS không tích điện và rất ưa nước, được sử dụng như chất làm tăng độ tan, tăng cường hấp thụ và làm chất mang cho các công thức khác nhau TPGS chủ yếu được nghiên cứu trong liposom và hạt nano polyme, giúp tăng cường sự hấp thu của tế bào, tăng khả năng gây độc tế bào và cho thấy thời gian lưu kéo dài [22,30]

TPGS dễ hấp thụ trong ống tiêu hóa, và ức chế P-glycoprotein là thụ thể vận chuyển đa thuốc, ở trong ruột tăng cường khả năng gây độc của chất chống ung thư như doxorubicin, vinblastin, paclitaxel và curcumin [49,50]

Tiềm năng quan trọng đã được chứng minh cho TPGS là trong ứng dụng hạt nano và các công nghệ dựa trên lipid để phân phối thuốc Cấu trúc hóa học của vitamin E TPGS gồm cả phần thân dầu và phần thân nước, dẫn đến nó có tính chất amphiphilic Hơn nữa, đuôi alkyl ưa mỡ và phần đầu ưa nước là cồng kềnh và có diện tích bề mặt lớn Đặc điểm như vậy khiến nó trở thành một chất nhũ hóa tốt, có khả năng nhũ hóa một loạt các hệ thống thân nước- dầu không thể trộn lẫn

Hình 9 C ng th c của TPGS

Hệ micel PLA - TPGS được tổng hợp dựa trên sự kết hợp của monome acid L-lactic (L-LA) đã được chứng minh là phân hủy sinh học nên an toàn cho cơ thể [46] và D-a-tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat (TPGS) có nguồn gốc từ vitamin E Hệ có cấu trúc vỏ-lõi, với lớp vỏ ưa nước (TPGS) và phần lõi kị nước (PLA) giúp làm tăng độ tan trong nước của các thuốc có độ tan thấp Copolyme PLA-TPGS (Hình 10) đã được ứng dụng vào nhiều hệ phân phối thuốc nano bởi tính an toàn, phân hủy sinh học tự nhiên, khả năng hướng đích tốt, cũng như dễ dàng tổng hợp được Thêm vào đó, TPGS được hấp thu một cách dễ dàng trong đường tiêu hóa và cũng có khả năng ức chế P- glycoprotein, là một protein vận chuyển đa thuốc từ trong tế bào chất ngược trở ra để bài tiết vào đường ruột Do đó cải thiện khả năng gây độc tế bào của nhiều hợp chất chống ung thư như doxorubicin, paclitaxel và curcumin [4,29]

Hình 10 C ng th c của copolyme PLA-TPGS

 Cơ chế m ng thuốc và c p yme PLA- TPGS Đối với các micel copolyme PLA- TPGS lõi kỵ nước gồm chuỗi PLA và đuôi alkyl thân nước của TPGS nên có thể bọc nhiều phân tử trị liệu nhỏ kị nước Cur và PTX đã được đóng gói vào các lõi vì kị nước của nó thông qua sự tương tác kỵ nước, lực Van der Waals, vv cung cấp một bề mặt ổn định giữa thuốc và môi trường nước ngoài [22] (Hình 11)

Hình 11 Hình ảnh củ các h t nano (PTX+Cur)/PLA-TPGS

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu

 Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

 Dòng HeLa (HeLa cancer cell line – Dòng tế bào ung thư HeLa)

 Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi)

 Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ)

Các tế bào trên được lấy từ Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm

Acid lactic (3,6-dimethyl-1,4-dioxan-2,5-dion, C6H8O4), D-a- Tocopheryl polyetylen glycol 1000 succinat (C33O5H54, vitamin E TPGS hay TPGS), N-hydroxysuccinimid (NHS), 1-[3-dimethylamino) propyl]-3- ethylcarbodiimid hydrochlorid (EDC), Thiếc Octoat (Sn(OOCC7H15)2), Toluen, Dichlometan, Metanol, Ethanol, Curcumin, Paclitaxel

Các hóa chất (trừ Cur) đều được mua từ Sigma- Aldrich và đạt độ sạch phân tích iêng Cur được mua từ viện hóa học, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn Lâm

PTX được mua từ Sigma- Aldrich và đạt độ sạch phân tích, số lô

Nước cất được sử dụng trong suốt quá trình thí nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tổng hợp copolyme PLA-TPGS

Copolyme PLA-TPGS (Hình 12) được tổng hợp bằng phương pháp mở vòng trùng hợp của L-LA và TPGS với sự có mặt của chất xúc tác octoat thiếc [Sn (Oct)2] [38] Tóm tắt, L-LA và TPGS với những tỉ lệ xác định được cho vào một bình đáy tròn 50ml, và được hòa tan trong 20ml toluen cũng được cho vào bình, hỗn hợp được đun nóng và khuấy bằng máy khuấy từ Khi nhiệt độ đạt đến 110 o C, 1ml Sn (Oct) 2 (0,5% w / v) được hòa tan trong 10ml toluen và bổ sung vào bình cầu Duy trì nhiệt độ ở 130 o C trong suốt 7 tiếng để thực hiện phản ứng mở vòng Sản phẩm thu được sẽ được hòa tan trong dichloromethan (DC ) và kết tủa trong methanol lạnh, ly tâm để thu được kết tủa Tủa thu được sau ly tâm đem sấy qua đêm, cuối cùng thu được copolyme PLA-TPGS dạng bột màu trắng [17]

Hình 12 C p yme PLA-TPGS được t o bởi monome L-LA và TPGS Để tối ưu hóa cấu trúc của hệ phân phối thuốc, chúng tôi tiến hành thay đổi tỉ lệ khối lượng giữa PLA và TPGS để tìm ra tỉ lệ nào có sự kết hợp giữa hiệu suất bọc thuốc, độ bền của hệ cũng như khả năng tiêu diệt các tế bào khối u là tốt nhất, phục vụ cho các nghiên cứu về sau Các mức tỷ lệ PLA:TPGS (w w) được thực hiện trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng sau:

Bảng 1 Tỉ lệ và khối ượng củ PLA và TPGS thực nghiệm

Tỉ lệ PLA: TPGS Khối ượng thử nghiệm(g)

2.2.2 Chuẩn bị dung dịch TPGS gắn với folat Đầu tiên, 100mg TPGS cùng 8,8 mg axit aspartic và 10mg EDC được hòa tan trong 10ml H2O, phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, sau 24h khuấy từ sẽ thu được dung dịch TPGS-COOH Tiếp đó, 35mg axit olic, 11,4mg EDC, 3,96 mg ethylen diamin và 18mg NHS được hòa tan hoàn toàn trong 7ml dung dịch NH4OH 2 và khuấy từ 6h ở 50 o C để tạo thành dung dịch Folat đã hoạt hóa ( ol-NHS) đồng nhất Sau đó, 100mg EDC và 25mg NHS được thêm vào dung dịch TPGS-COOH trên, khuấy từ 2h ở nhiệt độ phòng để thu được dung dịch TPGS-COOH hoạt hóa Trong bước tiếp theo, dung dịch này được nhỏ giọt từ từ vào dung dịch Fol-NHS và điều chỉnh pH đến 8 Cuối cùng dung dịch được khuấy từ tại 37 o C trong 4h [40]

2.2.3 Tổng hợp hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS gắn folat Đầu tiên, 10mg copolyme PLA-TPGS được cho vào 10ml DC và khuấy từ trong 2h Sau đó 10ml H2O được thêm vào hỗn hợp và tiếp tục khuấy cho đến khi lớp DCM trở nên trong suốt thì thu lấy lớp nước ở phía trên và thêm 1g TPGS vào lớp nước Đồng thời, dung dịch của Cur và PTX cũng được chuẩn bị bằng cách cho 4mg Cur và 4mg PTX cùng hòa tan vào 10ml EtOH Tiếp đó dung dịch thuốc được nhỏ từ từ vào lớp nước đã thu phía trên trong máy rung siêu âm Sản phẩm sau khi rung siêu âm được khuấy từ trong 24h ở nhiệt độ phòng Sau đó tiến hành đuổi dung môi EtOH và thêm vào 1ml dung dịch Folat đã hoạt hóa, khuấy từ trong 2h để tạo thành hạt nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol Hỗn hợp sau cùng được đem đi ly tâm và thu lấy phần dung dịch phía trên là phần chứa hệ phân phối thuốc nano để tiến hành các thử nghiệm về sau

2.2.4 Hiệu suất bọc thuốc (EE%)

Hiệu suất bọc thuốc (EE%) của PTX (hoặc Cur) của hệ nano được tính toán bởi độ hấp thụ cực đại UV-Vis tại các bước sóng 430 nm (đặc trưng cho Cur) và 227 nm (đặc trưng cho PTX) [14,20]

 Bước 1 : Xác định phương trình đường chuẩn Cur và PTX

- Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng (1) bao gồm EtOH : H2O với tỉ lệ 7:3

- Hòa tan hoàn toàn 2,000 mg Cur (PTX) trong 20,0ml dung dịch (1) thu được dung dịch (2)

- Đường chuẩn bao gồm dãy 5 dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm các thể tích tương ứng của dung dịch (2), sau đó bổ sung cho đủ 10,00ml bằng dung dịch (1) như trong Bảng 2:

Bảng 2 Dãy nồng độ 5 dung dịch chuẩn

Thể tích dung dịch 1(ml)

 Bước 2 : Định lượng Cur PTX có trong dung dịch chứa hệ phân phối thuốc nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol

- Lấy 0,20 ml mỗi dung dịch chứa hệ (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol tương ứng với 5 tỉ lệ của PLA- TPGS thêm vào 3,50 ml dung dịch EtOH và

- Tiến hành đo phổ hấp thụ UV-Vis và xác định độ hấp thụ cực đại của

5 dung dịch trên lần lượt ở các bước sóng 430 nm và 227 nm

- Dựa vào phương trình đường chuẩn của Cur và PTX thu được ở Bước

1 để xác định hàm lượng Cur và PTX có trong dung dịch (Cur+PTX)-PLA- TPGS-Fol

 Bước 3 : Hiệu suất bọc thuốc EE% được tính theo công thức:

2.2.5 Đánh giá các đặc trưng vật liệu

 Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (FTIR)

Phổ hồng ngoại của copolyme PLA-TPGS, Cur, PTX và nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS- ol được xác định bằng phương pháp hạt pellet KBr trong máy đo quang phổ hồng ngoại Perkin Elmer (Perkin Elmer Spectrum Two, Waltham, assachusetts, U.S.A) Vùng khảo sát nằm trong khoảng 400 -

4000 cm -1 nhằm xác định liệu có tổng hợp thành công hay không hệ micel (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol

 Xác định hình thái, kích thước hạt, thế zeta

Hình thái của hệ micel được xác định bằng máy đo SE Hitachi S-

4800 Thế zeta của hạt nano (Cur + PTX)-PLA-TPGS- ol được đo bởi bằng phương pháp phổ tán xạ laze động (DLS) trên máy đo thế Zetasize phiên bản 7.03, Malvern instruments Ltd, Malvern, UK

2.2.6 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào Phương pháp: Sử dụng phương pháp TT để đánh giá mức độ sống/chết tế bào ung thư dưới tác dụng của hệ phân phối thuốc nano (Cur+PTX)-PLA-TPGS-Fol với 5 tỉ lệ khác nhau của PLA-TPGS Thử nghiệm gây độc tế bào được tiến hành trên 4 dòng tế bào và tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm và Khoa học Công nghệ Việt Nam [35].

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN