BƯỚC đầu THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHĨ Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ HỒNG DIỆU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC   KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU KỸ SƯ NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Qua năm học tập trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đƣợc tiếp thêm nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu, mà tảng vững cho em sống sau Để có đƣợc thành cơng bƣớc đầu nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ba má ngƣời có cơng sinh thành, dƣỡng dục ln chỗ dựa tinh thần cho em sống, đặc biệt bốn năm đại học Cô Trần Thị Dân nhà giáo ƣu tú, tận tụy công tác, ngƣời vạch hƣớng nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài, đồng thời trình nghiên cứu tìm hiểu em đƣợc tiếp thu thêm nhiều kiến thức chuyên ngành lĩnh vực công nghệ sinh học sinh sản Thầy Nguyễn Văn Út ngƣời nổ nhiệt tình, thầy trực tiếp hƣớng dẫn, bảo, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực đề tài Cô Quách Tuyết Anh cung cấp tài liệu chuyên ngành bổ ích cho em làm sở áp dụng đề tài Cô Hồ Thị Nga giúp đỡ em thêm số trang thiết bị trình thực đề tài Hai anh Khƣu Tú Phát Nguyễn Bảo Khánh, Huỳnh Ngọc Thịnh Võ Khánh Hƣng ngƣời bạn chung nhóm đề tài với em, trực tiếp giúp đỡ, trao đổi, chia sẻ kinh nghiệm với em suốt trình thực đề tài Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn tới tất bạn bè, ngƣời giúp đỡ, chia sẻ với em nhiều học tập sống Sinh viên Trƣơng Thị Hoàng Diệu iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT TRƢƠNG THỊ HỒNG DIỆU Lớp DH03SH, Khóa 2003-2007, Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tên đề tài: “Bƣớc đầu thụ tinh ống nghiệm chó” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Kỹ sƣ NGUYỄN VĂN ÚT Thời gian tiến hành đề tài: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007 Địa điểm: phịng Ni cấy tế bào phịng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa Chăn ni Thú y, trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Thụ tinh ống nghiệm thành công bậc ngành công nghệ sinh học sinh sản Phôi nguồn nguyên liệu quan trọng công nghệ tế bào gốc, chuyển gen, tạo dòng, hay bảo tồn nguồn động vật quý hiếm…và chó lồi đáng đƣợc lƣu tâm Trong đề tài có thí nghiệm đƣợc tiến hành: Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để ni chín trứng Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Thí nghiệm 3: So sánh hiệu thụ tinh môi trƣờng Fert- TALP TYH Kết quả: Tỷ lệ trứng chín bổ sung β-mercaptoethanol với 50 µM 4,88%, 100 µM 1,65% đối chứng (0 µM ) 1,3% Tỷ lệ trứng nhìn thấy rõ giai đoạn 21,64% với nồng độ orcein 0,75% 28,19% với nồng độ 1% Tỷ lệ trứng thụ tinh môi trƣờng Fert- TALP 0,4%, môi trƣờng TYH 0% iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY TRUONG THI HOANG DIEU Class: DH03SH, course: 2003-2007, Biotechnology Department of Nong Lam University Advisor: Prof: TRAN THI DAN Engineer: NGUYEN VAN UT Name of thesis: “Preliminary results of in vitro fertilization in dog” Period: from the 1st Match, 2007 to the 15th August, 2007 Place: Cell culture lab, physiological and biochemical lab of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University In vitro fertilization technology is an important achievement in reproductive biotechnology Embryos are used for stem cell technology, animal breeding, conservation of valuable mammalian species,… including dog The thesis consists of three experiments: To evaluate the effect of different concentrations of β-mercaptoethanol on mature oocyte rate To examine the effect of different concentrations of orcein on staining oocyte result To compare the effect of TYH medium and Fert-TALP medium on in vitro fertilization result The results: Mature oocyte rate was 1,3% in control; 4,88% in 50 µM β-mercaptoethanol; 1,65% in 100 µM β-mercaptoethanol Defined oocyte rate was 21,64% in 0,75% orcein; 28,19% in 1% orcein Fertilized oocyte rate was 0,4% in Fert-TALP medium and 0% in TYH medium v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh mục chữ viết tắt x Danh mục hình biểu đồ xi Danh mục bảng xii Chƣơng : MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Buồng trứng 2.1.1 Vị trí, hình thái 2.1.2 Cấu tạo 2.1.3 Chức .3 2.2 Nang noãn 2.2.1 Đặc điểm hình thái 2.2.2 Sự phát triển nang noãn 2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng 2.2.4 Sự trƣởng thành nang noãn .7 2.2.4.1 Trƣởng thành nhân 2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất 2.2.5 Sự rụng trứng 2.3 Ni chín trứng ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) 2.3.1 Lịch sử IVM 2.3.2 Môi trƣờng IVM 10 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM 10 2.3.2.2 Thành phần môi trƣờng IVM 10 2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết IVM .12 2.3.3.1 Thời gian 12 2.3.3.2 Chất lƣợng noãn kích thƣớc nang nỗn .13 2.3.3.3 Tuổi tình trạng sinh dục chó 13 2.3.3.4 Thời gian nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng 13 2.4 Phó tinh hoàn 13 2.5 Tinh trùng 15 2.5.1 Nguồn gốc hình dạng .15 2.5.2 Quá trình sinh tinh .16 2.5.3 Cấu tạo .16 2.5.4 Thành phần 17 2.5.5 Đặc tính sinh lý 17 2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động tinh trùng 18 2.6 Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) 19 2.6.1 Lịch sử IVF 19 2.6.2 Cơ chế thụ tinh 20 2.6.3 Các giai đoạn phát triển phôi 21 2.6.4 Vật liệu cho IVF 22 2.6.4.1 Giao tử 22 2.6.4.2 Môi trƣờng IVF .22 2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro 23 2.6.6 Đánh giá kết thụ tinh 24 2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF 25 Chƣơng 3: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP 26 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 26 3.2 Nội dung nghiên cứu .26 3.3 Vật liệu 26 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3.1 Nguồn mẫu 26 3.3.2 Hóa chất .27 3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng 27 3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng 29 3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh .30 3.3.3 Dụng cụ - thiết bị .31 3.3.3.1 Dụng cụ .31 3.3.3.2 Thiết bị 31 3.4 Bố trí thí nghiệm 32 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để ni chín trứng 32 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 32 3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu thụ tinh môi trƣờng Fert-TALP TYH 32 3.5 Phƣơng pháp tiến hành 33 3.5.1 Thu nhận buồng trứng lò mổ 33 3.5.2 Xử lý buồng trứng .35 3.5.3 Tìm rửa trứng 35 3.5.4 Phân loại trứng trƣớc nuôi 35 3.5.5 Nuôi trứng 36 3.5.6 Thu nhận đánh giá trứng sau nuôi 36 3.5.6.1 Thu nhận trứng sau nuôi .36 3.5.6.2 Đánh giá trứng sau nuôi 37 3.5.7 Nhuộm trứng .38 3.5.8 Thu nhận tinh hồn lị mổ 39 3.5.9 Thu tinh trùng hoạt hóa tinh trùng 39 3.5.9.1 Quy trình thu nhận hoạt hóa tinh trùng 39 3.5.9.2 Các tiêu đánh giá tinh trùng thụ tinh in vitro: 39 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh 40 3.5.10.1 Thụ tinh môi trƣờng Fert-TALP 41 3.5.10.2 Thụ tinh môi trƣờng TYH 42 3.6 Xử lý số liệu 42 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 43 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu ni trứng bổ sung nồng độ β-mercaptoethanol 43 4.2 Thí nghiệm : Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 44 4.3 Thí nghiệm : So sánh hiệu thụ tinh môi trƣờng TYH Fert - TALP 47 4.4 Một số kinh nghiệm IVF 48 4.4.1 Lấy mẫu 48 4.4.2 Thao tác phòng thí nghiệm 49 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A Anaphase Kỳ sau BAS Bovine adult serum Huyết bò trƣởng thành BSA Bovine serum albumine Albumine huyết bò cm centimet COC Cumulus oocyte complex Phức hợp trứng - cumulus Cộng tác viên Ctv ECS Estrous cow serum Huyết bò lên giống EGF Epidermal growth factor Nhân tố tăng trƣởng biểu mô Cộng Et al FCS Fetal calf serum Huyết thai bị FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn GSH Glutathione GV Germinal vesicle Túi mầm GVBD Germinal vesicle break down Phá vỡ túi mầm In vitro Trong ống nghiệm In vivo Trong thể sống UI Unit international Đơn vị quốc tế IVC In vitro culture Nuôi cấy ống nghiệm IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm IVM In vitro maturation Trƣởng thành ống nghiệm LH Luteinizing hormone Hormone kích thích thể vàng M Metaphase Kỳ mm milimet NCSU North Carolina State University T Telophase Kỳ cuối x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 Trứng trƣởng thành Tinh trùng Rửa trứng 2-3 lần Hoạt hóa tinh trùng môi trƣờng thụ tinh (phƣơng pháp Swim-up) Tạo vi giọt: 10 COCs/giọt, ủ ấm Đánh giá IVF: bơm tinh trùng tiêu vào vi giọt Cho đĩa thụ tinh vào ủ ấm: % CO2, 37oC Sau 24 Nhuộm trứng để đánh giá hình thành tiền nhân Sơ đồ 3.2 Quy trình thụ tinh 3.5.10.1 Thụ tinh môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006) Chuẩn bị vi giọt mơi trƣờng Fert-TALP (44 µl/giọt) đĩa petri, phủ dầu khoáng đƣợc ủ ấm Hút trứng đƣợc nuôi 72 khỏi giọt nuôi, rửa lần Sperm-TALP Chuyển trứng vào vi giọt đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt Hút µl tinh trùng đƣợc hoạt hóa (nồng độ 2,5.107 tế bào/ml) cho vào giọt thụ tinh Tiếp theo cho µl heparin vào giọt thụ tinh Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm 5%CO2, 37oC nuôi 24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 3.5.10.2 Thụ tinh môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992) Chuẩn bị vi giọt mơi trƣờng TYH (100 µl/giọt) đĩa petri, phủ dầu khống ủ ấm Hút trứng đƣợc ni 72 khỏi giọt nuôi, rửa lần TYH Chuyển trứng vào vi giọt đƣợc ủ ấm, 10 COCs/giọt Hút 10 µl tinh trùng đƣợc hoạt hóa (nồng độ 107 tế bào/ml) cho vào giọt thụ tinh Cho đĩa thụ tinh vào tủ ấm % CO2, 37oC nuôi 24 3.6 Xử lý số liệu Xử lý thống kê trắc nghiệm ANOVA sau chuyển dạng arcsin phần mềm Stagraphic 7.0 Kết đƣợc trình bày dƣới dạng X ± SE LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 Chƣơng KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để ni chín trứng β-mercaptoethanol có vai trị cải thiện tỷ lệ chín trứng phát triển phơi số lồi động vật, có vai trị gián tiếp việc tổng hợp glutathione (GSH) - hợp chất quan trọng bảo vệ tế bào khỏi tác nhân oxy hóa Thí nghiệm bổ sung nồng độ β-mercaptoethanol khác (0 µM, 50 µM 100 µM) vào mơi trƣờng ni trứng Bảng 4.1 Tỷ lệ trứng chín với nồng độ β-mercaptoethanol Nồng độ β-mercaptoethanol Số lô Số trứng ni Tỷ lệ trứng chín P (%) ( µM) 10 249 1,3 ± 0,54a 50 10 259 4,88 ± 1,37b 100 10 255 1,65 ± 0,6a 0,02 tỷ lệ trứng chín (%) 4.88 1.65 1.3 0 50 100 nồng độ β-mercaptoethanol ( µM) Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ trứng chín với nồng độ β-mercaptoethanol LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 Từ kết cho thấy tỷ lệ trứng chín trƣờng hợp đối chứng với trƣờng hợp bổ sung 50 µM 100 µM có khác biệt mặt thống kê (p0,05) nồng độ orcein 0,75% nồng độ 1% Trung bình 21,64% nồng độ 0,75% 28,19% nồng độ 1% Nhƣ thế, sử dụng nồng độ không ảnh hƣởng nhiều tới khả bắt màu nhiễm sắc thể orcein Tuy nhiên, điều đáng nói tỷ lệ nhìn thấy rõ giai đoạn nhiễm sắc thể thấp, điều gây sai lệch việc đánh giá tỷ lệ trứng chín để làm sở cho trình thụ tinh Các yếu tố gây ảnh hƣởng là: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 Kinh nghiệm ngƣời thao tác: tất khâu q trình nhuộm trứng thủ cơng, kinh nghiệm yếu tố quan trọng để giữ trứng không bị thất lạc trình thao tác ngâm dung dịch acetic-ethanol Orcein để thời gian lâu bị lắng, làm giảm khả bắt màu nhiễm sắc thể, để lâu nên acetic ethanol bay làm sai lệch nồng độ GV GVBD MI MII Hình 4.1 Các giai đoạn phát triển trứng nhuộm orcein Hình 4.2 Trứng nhuộm orcein khơng nhìn thấy rõ giai đoạn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu thụ tinh môi trƣờng TYH Fert- TALP Yamada et al (1992) khảo sát tỷ lệ xuất tiền nhân đực sau 12 thụ tinh 37% môi trƣờng TYH Kim et.al (2006) khảo sát tỷ lệ xuất tiền nhân sau 20 thụ tinh 28% môi trƣờng Fert-TALP Trong đề tài tiến hành thử nghiêm thụ tinh hai môi trƣờng trên, sau 24 thụ tinh tiến hành nhuộm orcein để quan sát hình thành tiền nhân Bảng 4.3 Tỷ lệ hình thành tiền nhân TYH Fert-TALP Mơi trƣờng Số trứng đạt Tỷ lệ tiền nhân (%) 252 0,4 213 0 Số lô Số trứng thụ tinh Fert-TALP 15 TYH 12 thụ tinh Hình 4.3 Tiền nhân sau 24 Từ kết cho thấy tỷ lệ hình thành tiền nhân thí nghiệm thấp so với kết Yamada et al (1992) Kim et al (2006) Trong mơi trƣờng TYH khơng có kết tạo thành tiền nhân, cịn dùng mơi trƣờng Fert-TALP có tiền nhân đƣợc hình thành Tuy nhiên nói mơi trƣờng Fert-TALP dùng quy trình tƣơng đối phù hợp môi trƣờng TYH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 Một số nguyên nhân làm cho tỷ lệ thụ tinh thấp:  Tỷ lệ trứng chín thấp  Lớp lipid nội chất trứng chó nhiều khó quan sát đƣợc thể cực sau 72 nuôi nên hầu hết trứng sau nuôi đƣợc đánh giá theo kinh nghiệm mang thụ tinh  Thí nghiệm nhuộm trứng orcein chƣa đạt tỷ lệ cao, việc đánh giá tỷ lệ trứng chín chƣa đƣợc xác, điều gây khó khăn cho việc bổ sung chất khác (β-mercaptoethanol, EGF…) vào môi trƣờng để tăng hiệu chín trứng  Tinh trùng thí nghiệm lấy trực tiếp từ phần phó tinh hồn chó đực từ lị mổ nên chất lƣợng tinh trùng khơng ổn định (nồng độ hoạt lực), chó đực bị nhốt vài ngày trƣớc mổ nên dễ bị stress, thời gian chó cịn bị bỏ đói… ảnh hƣởng lớn đến khả sinh tinh chất lƣợng tinh trùng Do mà nồng độ hoạt lực tinh trùng sau hoat hóa thƣờng khơng cao có thấp nồng độ cần cho thụ tinh nhiều  Trong môi trƣờng thụ tinh thiếu thành phần PHE stock so với mơi trƣờng thụ tinh Kim et.al (2006), PHE stock có hypotaurine yếu tố bảo vệ áp suất thẩm thấu mơi trƣờng  Điều kiện thí nghiệm chƣa đạt điều kiện vô trùng nên dễ bị tạp nhiễm thao tác 4.4 Một số kinh nghiệm IVF 4.4.1 Lấy mẫu Đặc tính sinh lý sinh sản chó khác với lồi khác Do đó, tỷ lệ trứng chín IVM hình thành phơi IVF thấp Mặt khác, theo khảo sát Lâm Thị Ngọc Thanh (2006), tỷ lệ trứng thu đƣợc tỷ lệ trứng chín cao giai đoạn xoang nang, nên chọn chó giai đoạn động dục trƣớc động dục Chó đực phải có tinh hồn lớn nhằm đảm bảo nồng độ hoạt lực tinh trùng cho thụ tinh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 Dung dịch trữ mẫu phải đƣợc bổ sung kháng sinh vào ngày lấy mẫu để hạn chế nhiễm khuẩn Mẫu sau lấy phải đƣợc vận chuyển nhanh phịng thí nghiệm nhanh tốt Buồng trứng nên đƣợc trữ 37oC trình bảo quản Chú ý khâu sát trùng mẫu dụng cụ nguồn mẫu lấy từ ngồi nên khả nhiễm cao 4.4.2 Thao tác phòng thí nghiệm Tinh hồn nhƣ chƣa đƣa vào tủ cấy làm liền phải đƣợc trữ tủ lạnh, nhằm hạn chế hoạt động tinh trùng kéo dài thời gian sống tinh trùng Tinh hồn buồng trứng sau mang phịng thí nghiệm phải đƣợc sát trùng cẩn thận, tiến hành cắt bỏ màng bao ngoài, cho vào đĩa petri đƣợc dán chặt keo parafilm để hạn chế nhiễm khuẩn Tủ cấy dụng cụ thao tác phải đƣợc chiếu tia UV trƣớc lần làm, tất dụng cụ phải đƣợc sát trùng cẩn thận trƣớc mang vào phịng cấy tủ cấy vơ trùng Tinh trùng từ phần phó tinh hồn đƣợc lấy trực tiếp từ lị mổ, hoạt lực nồng độ thƣờng không ổn định nên tốt tiến hành hoạt hóa tinh trùng liền sau mang mẫu phịng thí nghiệm Thao tác hoạt hóa đếm tiêu tinh trùng phải tiến hành nhanh xác tinh trùng sau hoạt hóa dễ bị kết dính thời gian sống khơng lâu, ảnh hƣởng lớn đến hiệu thụ tinh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bổ sung β-mercaptoethanol vào môi trƣờng nuôi trứng tăng tỷ lệ trứng chín: đạt 1,3% khơng bổ sung, 4,88% bổ sung 50 µM, 1,65% bổ sung 100 µM Nhuộm trứng với nồng độ orcein 0,75% hay 1% không cho kết khác biệt mặt thống kê Tỷ lệ nhìn thấy rõ giai đoạn trứng nhuộm với nồng độ 0,75% 21,64% với nồng độ 1% 28,19% Tỷ lệ trứng thụ tinh cịn thấp, mơi trƣờng Fert-TALP 0,4% môi trƣờng TYH 0% 5.2 Đề nghị Nên bổ sung β-mercaptoethanol với nồng độ 50 µM vào mơi trƣờng nuôi trứng Nghiên cứu bổ sung EGF, huyết chó lên giống với nồng độ thích hợp vào mơi trƣờng ni trứng để tăng tỷ lệ trứng chín Dùng tinh trùng từ nhiều nguồn để đảm bảo nồng độ hoạt lực tinh trùng nhằm cải thiện hiệu thụ tinh Bổ sung thành phần PHE stock (2µl/giọt) vào mơi trƣờng thụ tinh Thử nghiệm quy trình tạo phơi chó mơi trƣờng TYH, TYH dùng cho tất giai đoạn ni trứng, hoạt hóa tinh trùng, thụ tinh nuôi phôi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt, 1997 Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm NXB Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Ngơ Duy Bình, 2007 Khảo sát ảnh hưởng EGF (epidermal growth factor) lên trưởng thành trứng bò in vitro Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh Quách Hoa Thiên Cung, 2007 Tạo phơi bị kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh Trần Thị Dân Dƣơng Nguyên Khang, 2006 Sinh lý vật nuôi NXB Nông Nghiệp Phạm Thị Minh Đức, 2001 Sinh lý học, tập NXB Y học Hà Nội Nguyễn Thị Hà, 2007 Thử nghiệm tạo phôi dâu kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm heo Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005 Khảo sát khả khai thác tinh chó khả bảo quản số môi trường pha chế tinh Luận văn thạc sĩ, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Đỗ Hồng Khiêm, 2006 Một số yếu tố ảnh hưởng kết nuôi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng phản ứng hoạt hóa tinht trùng chó Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh hóa tinh Nguyễn Quang Mai Cù Xuân Dần, 2005 Sinh lý học vật nuôi NXB Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 10 Phan Kim Ngọc Phạm Văn Phúc, 2006 Công nghệ sinh học người động vật NXB Giáo Dục 11 Nguyễn Đình Nhung Nguyễn Minh Tâm, 2005 Giáo trình giải phẩu sinh lý vật nuôi NXB Hà Nội LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 12 Lâm Thị Ngọc Thanh, 2006 Đánh giá ảnh hưởng số yếu tố sinh học lên chất lượng nỗn chó điều kiện ni chín in vitro Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh 13 Nguyễn Bạch Thảo Vy, 2005 Áp dụng quy trình ni chín nỗn in vitro heo chó Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 14 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2005 Công nghệ sinh học, tập 2: Công nghệ sinh học tế bào NXB Giáo Dục Tài liệu tiếng Anh 15 Ada Rota and Giorgina Cabianca, 2004 In vitro maturation rates of canine oocytes from anestrous bitches in simple media Reprod Nutr Dev 44: 105-109 16 Berenice de Avila Rodrigues, Lucila Carboneiro Dos Santos and Jose Luiz Rodrigues, 2004 Embryonic development of in vitro matured and in vitro fetilized dog oocytes Molecular reproduction and development 67: 215-223 17 Cole H.H and Cupps, 1959 Reproduction in domestic animals Academic press, New York and London, pp 342 – 345, 369 – 374 18 Dela Pena E.C., Takahashi Y., Katagiri S., Atabay E.C and Nagano M., 2002 Birth of pups after transfer of mouse embryos derived from vitrified preantral follicles Reproduction 123: 593-600 19 Downs S.M and Hudson E.D., 2000 Energy subtrates and the completion of spontaneous meiotic maturation Zygote, 8: 339 – 351 20 Masaya Geshi and Naoki Takenouchi, 2000 Effects of sodium pyruvate in nonserum maturation medium on maturation fertilization, and subsequent development of bovine oocytes with or without cumulus cells Biol Reprod., 63: 1730 – 1734 21 Matins L.R., Ponchirolli C.B., Beier S.L., Landim-Alvarenga F.C and Lopes M.D., 2006 Analysis of nuclear maturation in in vitro matured oocytes from estrous and anestrous bitches Anim Reprod., v.3, n.l, p.49-54 22 Kim Kyu Min, Fibrianto Heru Yuda, Oh Ju Hyun, Jang Goo, Kim Jin Hye, Lee Seung Kyu, Kang Keun Sung, Lee Chun Byeong and Hwang Suk Woo, 2005 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 53 Effects of estradiol-17β and progesteron supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes Theriogenology 63 [Abstract] 23 Kim Kyu Min, Fibrianto Heru Yuda, Oh Ju Hyun, Jang Goo, Kim Jin Hye, Lee Seung Kyu, Kang Keun Sung, Lee Chun Byeong and Hwang Suk Woo, 2004 Effect of β-mercaptoethanol or epidermal growth factor supplementation on in vitro maturation of canine oocytes collected from dogs with different stages of the estrus cycle J Vet Sci (3): 253-258 24 Otoi T., Fujii M., Tanaka M., Ooka A and Suzuki T., 1999 Effects of serum on the in vitro maturation of canine oocytes Reprod Fertil Dev., 11:387 – 390 25 CuiXiang-Shun, Jin Yong-Xun, Shen Xing-Hui, Lee Jae-Yeong, Lee Hyo-Sang, Yin Xi-Jun, Kong Il-Keun and Kim Nam-Hyung, 2006 Epidemal growth factor enhances meiotic resumption of canine oocytes in the presence of BSA Theriogenology 66: 267-274 26 Yamada S., Shimazu Y., Kawaji H., Nakazawa M., Naito K and Toyoda Y., 1992 Maturation, fertilization, and development of dog oocyte in vitro Biology of reproduction 46: 853-858 27 Jin Yong-Xun, Lee Hyo-Sang, Yin Xi-Jun, Cui Xiang-Shun, Kong Il-Keun and Kim Nam-Hyung, 2006 Chromatin, microtubule and microfilament configurations in the canine oocyte Reproduction, fertility and development 18: 849-856 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Thí nghiệm1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để ni chín trứng One-Way Analysis of Variance -Data: MERCAPTO.Ty_le_chin Level codes: MERCAPTO.Nong_do Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -Between groups 0077643 0038821 4.582 0193 Within groups 0228754 27 0008472 -Total (corrected) 0306396 29 missing value(s) have been excluded 09/05/07 04:53:48 AM Page Table of means for MERCAPTO.Ty_le_chin by MERCAPTO.Nong_do -Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -1 10 0129910 0054492 0092045 -.0003667 0263487 10 0487369 0137292 0092045 0353792 0620946 10 0165003 0059988 0092045 0031426 0298580 -Total 30 0260761 0053142 0053142 0183640 0337881 09/05/07 04:54:08 AM Page Multiple range analysis for MERCAPTO.Ty_le_chin by MERCAPTO.Nong_do Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 10 0129910 X 10 0165003 X 10 0487369 X contrast difference limits - -0.03575 0.02672 * - -0.00351 0.02672 - 0.03224 0.02672 * * denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng One-Way Analysis of Variance -Data: ORCEIN.Ty_le_thay Level codes: ORCEIN.Nong_do Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -Between groups 0634861 0634861 1.304 2573 Within groups 3.4561832 71 0486786 -Total (corrected) 3.5196693 72 missing value(s) have been excluded 09/05/04 06:08:23 PM Page Table of means for ORCEIN.Ty_le_thay by ORCEIN.Nong_do -Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -1 23 2147045 0328294 0460050 1498259 2795831 50 2781867 0344688 0312021 2341839 3221894 -Total 73 2581854 0258231 0258231 2217685 2946024 09/05/04 06:08:41 PM Page Multiple range analysis for ORCEIN.Ty_le_thay by ORCEIN.Nong_do -Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -1 23 2147045 X 50 2781867 X -contrast difference limits - -0.06348 0.11086 -* denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... thống thụ tinh in vitro (Phan Kim Ngọc, 2006) Có yếu tố quan trọng hệ thống thụ tinh in vitro: dụng cụ thụ tinh, môi trƣờng thụ tinh điều kiện khác (khí, nhiệt độ, độ ẩm mơi trƣờng…) Thụ tinh ống. .. chƣa thực chó Vì lý mà đề tài “Bƣớc đầu thụ tinh ống nghiệm chó? ?? đƣợc tiến hành LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.2 Mục tiêu Bƣớc đầu tìm quy trình thụ tinh ống nghiệm. .. thân phó tinh hồn Tại phó tinh hồn, tinh trùng đƣợc cung cấp yếu tố làm tăng khả thụ tinh, tinh trùng phó tinh hồn có khả thụ tinh cao tinh trùng phần thân, có khả thụ tinh mà khơng cần bổ sung