(LUẬN văn THẠC sĩ) nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho gamma delta t từ bệnh nhân ung thư phổi​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quý Linh NUÔI CẤY HOẠT HĨA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT) TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019 download by : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Q Linh NI CẤY HOẠT HĨA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT) TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung PGS.TS Trần Huy Thịnh Hà Nội – Năm 2019 download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Hồng Thị Mỹ Nhung, Trưởng Bộ mơn Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội PGS.TS Trần Huy Thịnh, phó Trưởng Bộ mơn Hóa sinh, Phó giám đốc Trung tâm kiểm định chất lượng xét nghiệm y học, Trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, người thầy định hướng, tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS.BS Tạ Thành Văn, Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen-protein, Trường Đại học Y Hà Nội , PGS.TS.BS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa Kỹ thuật Y Học, phó Giám đốc tồn thể cán Trung tâm nghiên cứu Genprotein, Trường đại học Y Hà Nội, nơi tơi gắn bó 10 năm, tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, làm việc nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS BS Nguyễn Thanh Bình anh chị Kỹ thuật viên Khoa Xét nghiệm Huyết Học bệnh viện Nhi Trung Ương tận tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bệnh nhân người tình nguyện giúp đỡ để tơi thực nghiên cứu Cuối xin ghi nhớ cơng ơn sinh thành, ni dưỡng tình u thương cha mẹ tôi, vợ hai trai người thân gia đình bạn bè, người bên tôi, động viên chỗ dựa vững cho yên tâm học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019 Học viên NGUYỄN QUÝ LINH i download by : skknchat@gmail.com Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) diệt tự nhiên (NK) điều trị ung thư phổi”, mã số: KC.10.26/16-20, thuộc chương trình: “Nghiên cứu ứng dụng phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, KC.10/16-20 ii download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Quý Linh, học viên cao học khóa 26 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, khoa Sinh học, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Huy Thịnh PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Cơng trình khơng trùng lập với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, phần kết Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) diệt tự nhiên (NK) điều trị ung thư phổi”đã chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019 Người viết cam đoan NGUYỄN QUÝ LINH iii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ C n TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan un t p ổi 1.1.1 Dịch tễ học ung thư phổi 1.1.2 Các yếu tố nguy 1.1.3 Đáp ứng miễn dịch ung thư phổi 1.2 Tổng quan liệu pháp tế bào miễn dịch tự t ân γδT tách từ máu ngoại vi tron điều trị un t phổi 10 1.2.1 Giám sát miễn dịch né tránh đáp ứng miễn dịch ung thư 10 1.2.2 Vi môi trường quanh khối u tính sinh miễn dịch ung thư phổi 12 1.2.3 Liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư 12 1.2.4 Các liệu pháp miễn dịch dùng điều trị ung thư 15 1.2.5 Vai trò, đặc điểm chức tế bào γδT 20 1.2.6 Sự hoạt hoá nhận diện tế bào ung thư tế bào T 22 1.2.7 Cơ chế tác dụng kháng ung thư tế bào T 24 1.2.8 Liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân điều trị ung thư 26 1.2.9 Ni cấy hoạt hố, biệt hố tăng sinh tế bào T ứng dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân điều trị ung thư 28 1.2.10 Ứng dụng tế bào T điều trị ung thư phổi 30 C n ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 Đối t ợng nghiên cứu 33 2.1.1 Cỡ mẫu 33 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu 33 22 P n p áp n iên cứu 34 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 34 2.2.2 Nội dung số nghiên cứu thu thập ban đầu 35 2.2.3 Phương pháp thu thập mẫu 36 iv download by : skknchat@gmail.com 2.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 36 2.2.5 Các phương pháp kỹ thuật sử dụng 38 2.3 Xử lý số liệu 43 2.4 Đạo đức nghiên cứu 44 C n KẾT QUẢ 45 3.1 Chuẩn hóa quy trình phân lập, ni cấy tế bào γδT mẫu n ời khỏe mạnh 45 3.2 Số l ợng tế bào miễn dịc γδT t u đ ợc sau nuôi cấy 52 3.2.1 Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu sau nuôi cấy người tình nguyện khỏe mạnh 52 3.2.2 Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu sau nuôi cấy bệnh nhân ung thư phổi 55 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào t u đ ợc sau nuôi cấy 57 3.3.1 Xác định tỷ lệ tế bào γδT quần thể tế bào sau nuôi cấy người khỏe mạnh 58 3.3.2 Xác định tỷ lệ tế bào γδT quần thể tế bào sau nuôi cấy bệnh nhân ung thư phổi 61 Đán iá mức độ hoạt hóa hoạt tính tế bào miễn dịc γδT sau nuôi cấy 64 3.4.1 Khả tiết IFNγ tế bào γδT vào môi trường ni cấy sau hoạt hóa, tăng sinh 64 3.4.2 Hoạt tính gây độc cho tế bào tế bào γδT sau nuôi cấy 70 KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đáp ứng miễn dịch ung thư phổi Hình 1.2 Tác dụng chemokine TAMs MDSCs 10 Hình 1.3: Q trình hoạt hố, nhận diện kháng nguyên đáp ứng miễn dịch kháng ung thư tế bào T 23 Hình 1.4: Cơ chế tác dụng kháng ung thư tế bào γδT 25 Hình 1.5: Minh hoạ giai đoạn q trình sử dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T điều trị ung thư 27 Hình 1.6: Minh hoạ khả ly giải tế bào ung thư phổi thực nghiệm tế bào T tách từ máu ngoại vi người, nuôi cấy hoạt hoá với kháng nguyên phosphor 31 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm mơ tả tiến cứu 35 Hình 2.2 Liệu trình phân lập, ni cấy hoạt hóa tăng sinh tế bào γδT 36 Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng tế bào miễn dịch nồng độ zoledromate IL-2 khác 45 Hình 3.2: Hình ảnh tế bào miễn dịch γδT sau ni cấy nồng độ zoledronate/IL-2 khác 46 Hình 3.3: Hình ảnh xác định tỷ lệ tế bào γδT quần thể tế bào thu sau nuôi cấy nồng độ zoledronate IL-2 khác 47 Hình 3.4: Hình ảnh tế bào người khỏe mạnh C02 trước sau nuôi cấy 53 Hình 3.6: Hình ảnh tế bào bệnh nhân ung thư BN01 trước sau nuôi cấ 56 Hình 3.7: Hình ảnh tế bào bệnh nhân ung thư BN05 trước sau ni cấy 57 Hình 3.8: Kết đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu C02 59 Hình 3.9: Kết đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu BN06 62 Hình 3.10: Mức độ biểu mRNA IFNγ tế bào γδT trước sau nuôi cấy 66 Hình 3.11: Nồng độ IFNγ mơi trường tế bào trước sau ni cấy 68 Hình 3.12: Hoạt tính gây độc tế bào tế bào lympho γδT sau 14 ngày nuôi cấy 71 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm loại tế bào lympho T 20 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 41 Bảng 2.2 Trình tự mồi gen IFNγ Vγ9 41 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng Realtime PCR 42 Bảng 3.1: Số lượng tế bào miễn dịch γδT nuôi cấy nồng độ zoledronate IL-2 khác 45 Bảng 3.2: Tỷ lệ tế bào lympho T γδT quần thể tế bào thu sau nuôi cấy 48 Bảng 3.3: Số lượng tế bào nhóm người tình nguyện khỏe mạnh sau ni cấy 52 Bảng 3.4: Số lượng tế bào nhóm bệnh nhân ung thư phổi thu sau nuôi cấy 55 Bảng 3.5: Tỷ lệ tế bào γδT người tình nguyện khỏe mạnh trước sau ni cấy 58 Bảng 3.6: Tỷ lệ tế bào γδT bệnh nhân ung thư phổi trước sau nuôi cấy 61 Bảng 3.7: Kết đánh giá mức độ biểu mRNA IFNγ trước sau nuôi cấy 64 Bảng 3.8: Nồng độ IFNγ trước sau ni cấy hoạt hóa (pg/ml) 67 vii download by : skknchat@gmail.com ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi bệnh có tỷ lệ mắc tử vong hàng đầu số loại ung thư giới Theo ghi nhận Globocan năm 2018, số ca mắc ung thư phổi toàn giới 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc ung thư số ca tử vong ung thư phổi 1,76 triệu ca, chiếm 18,4% tổng số ca tử vong ung thư [11] Tại Mỹ, nước có hệ thống y tế đại phát triển, theo ACS ước tính năm 2019 có 234.030 ca mắc mới, chiếm 13% tổng số ca mắc ung thư 142.670 ca tử vong [110] Tại Việt Nam, theo Globocan năm 2018, tỷ lệ mắc ung thư phổi xếp thứ hai nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) xếp thứ ba nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mắc ung thư phổi 114.871 người tử vong bệnh [38] Từ đó, việc phát triển phương pháp điều trị việc phối hợp phương pháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời gian sống thêm không bệnh sống thêm toàn thể với bệnh nhân ung thư phổi điều có ý nghĩa Trên giới nay, liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân phát triển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư phổi cho kết ban đầu hứa hẹn [8,49,141] Từ năm 2017, trường Đại học Y Hà Nội thiết lập quy trình tách, ni cấy hoạt hóa, biệt hóa tăng sinh tạo khối tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 Bộ Y Tế cho ứng dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 điều trị thử nghiệm lâm sàng năm loại ung thư sau: ung thư phổi, ung thư gân, ung thư vú, ung thư dày, ung thư đại trực tràng Việc triển khai đề tài “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta ɣδT diệt tự nhiên NK điều trị ung thư phổi” trường Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân Y, Bệnh viện K Trung ương thiết thực cung cấp thêm liệu pháp điều trị cho bệnh nhân ung thư nước ta Với liệu pháp này, bệnh nhân cần đến sở lấy lượng máu định, sau trở nhà quay lại sở để truyền tế bào miễn dịch ni cấy hoạt hóa, biệt hóa tăng sinh sau tuần Hiệu phương pháp phụ thuộc nhiều vào việc tối ưu hóa mơi trường download by : skknchat@gmail.com ... hóa t? ?? bào γ? ?T tách t? ?? bệnh nhân ung thư phổi Bước đầu đánh giá t? ?nh đáp ứng miễn dịch t? ?? bào γ? ?T tách t? ?? bệnh nhân ung thư phổi ho? ?t hóa download by : skknchat@gmail.com C 1.1 T? ??ng quan un t 1.1.1... trị ung thư phổi, tiến hành nghiên cứu ? ?Nuôi cấy ho? ?t hóa đánh giá t? ?nh đáp ứng miễn dịch t? ?? bào γ? ?T tách t? ?? bệnh nhân ung thư phổi”, với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình phân lập ni cấy ho? ?t hóa. .. t? ?? thân T- CD8 Bộ Y T? ?? cho ứng dụng liệu pháp t? ?? bào miễn dịch t? ?? thân T- CD8 điều trị thử nghiệm lâm sàng năm loại ung thư sau: ung thư phổi, ung thư gân, ung thư vú, ung thư dày, ung thư đại trực